본 연구는 단일 세포 수준에서 세포 독성 가능성을 더 잘 이해하기 위해 단일 effector CAR T 세포를 표적 세포와 캡슐화하여 CAR T 세포의 기능적 다양성을 평가하는 데 중점을 두고 있습니다. 현재의 세포독성 분석은 대량으로 수행되는 경우가 많기 때문에 제한적입니다. 이는 개별 CAR T-세포 간의 차이를 간과하고 표적에 대한 다양한 반응을 보이는 뚜렷한 하위 집단을 식별하지 못합니다.
당사의 기술은 표준 유세포 분석기 및 세포 주문을 사용하여 단일 세포 형식으로 다중 세포 사멸 분석을 가능하게 합니다. 이것은 이웃 세포의 간섭이 없기 때문에 벌크 프로토콜보다 더 정확한 결과를 제공합니다. 우리는 이러한 유형의 연구를 통해 우리와 다른 과학자들이 CAR의 더 미세한 세부 사항과 단일 세포 수준에서 어떻게 기능하는지 더 잘 조사할 수 있기를 바랍니다.
먼저 Dulbecco의 PBS에서 두 가지 형광 염료의 원액을 1:5, 000 비율로 희석합니다. 세포를 별도의 15ml 튜브로 옮깁니다. 튜브를 300g에서 5분 동안 원심분리합니다.
상등액을 제거하고 effector cell pellets를 보라색 형광 염료의 작동 용액에 재현탁시킵니다. 표적 세포 펠릿을 원적외선 형광 염료의 작업 용액에 재현탁합니다. 염색된 세포를 섭씨 37도의 가습된 이산화탄소 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다.
배양 후 300g에서 세포를 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 세포 펠릿을 15ml의 완전한 RPMI 1640 배지에 재현탁하여 세척합니다. 세척하고 다시 원심 분리하십시오.
그런 다음 상층액을 제거하고 225 μlit의 완전한 RPMI 1640 배지에 effector 세포 펠릿을 재현탁하고 동일한 배지의 450 microlit에 타겟 세포 펠릿을 재현탁합니다. 30마이크로리터의 그래디언트 배지를 effector cell 현탁액에 추가하고 60μlit를 타겟 cell 현탁액에 추가합니다. 파이펫팅하기 전에 그래디언트 배지 스톡 용액을 잘 혼합합니다.
다음으로, Granzyme B 기판 스톡을 완전한 RPMI 1640 배지로 미리 희석합니다. 피펫, 요오드화 페리듐 원액 및 희석된 Granzyme B 기질을 effector 세포 현탁액 및 표적 세포 현탁액에 연결합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 용액을 잘 혼합합니다.
세포를 캡슐화하려면 캡슐화 카트리지와 안정화 용액을 실온으로 예열합니다. 세포를 위한 완전한 RPMI 1640 배지 33% 안정화 용액과 10% 그래디언트 배지를 추가합니다. 그리고 그것들을 혼합하여 외부 매체의 스톡을 준비하십시오.
각 캡슐화 샘플에 대해 1.5ml 튜브에서 65마이크로리터의 준비된 효과기 세포 현탁액과 65마이크로리터의 준비된 표적 세포 현탁액을 혼합합니다. 피펫으로 세포를 잘 재현탁시킵니다. encapsulation cartridge의 표시된 well에 주어진 순서로 시약을 로드합니다.
Reese는 로딩 직전에 피펫으로 세포를 잘 매달아 놓습니다. 개스킷을 카트리지에 조심스럽게 밀봉합니다. 카트리지를 미세유체 장치로 옮긴 다음 사용 설명서에 따라 캡슐화를 시작합니다.
실행이 완료된 후 카트리지를 제거하고 오버레이 배지에 다시 현탁시키고 뚜껑이 있는 2밀리리터 DNA 저결합 튜브로 옮겨 웰 D에서 방울을 수확합니다. 웰 A의 나머지 외부 매체로 웰 D를 세척하여 나머지 액적을 수집합니다. 비말이 수집 튜브에 침전되면 현미경 검사 전에 튜브에서 명확하게 구별되는 두 개의 단계를 확인합니다.
10마이크로리터 피펫 팁의 약 1/3을 액적 층 표면의 물방울로 채웁니다. 그런 다음 피펫 팁의 나머지 약 2/3를 오버레이 매체로 채웁니다. 즉시 샘플을 8개의 챔버 유리 슬라이드에 로드합니다.
4x 및 20x 배율에서 액적을 현미경으로 검사하여 세포에 액적 포집이 있는지 확인합니다. 배양의 경우 21 게이지 주사기 바늘을 사용하여 필요한 수의 2 밀리리터 DNA 저결합 튜브의 뚜껑에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 각 배양 튜브에 1ml의 외부 배지를 추가합니다.
오버레이 배지에서 생성된 액적을 재현탁하고 각 생산을 준비된 3개의 배양 튜브로 분할합니다. 튜브를 인큐베이터에 똑바로 세워 액적 생성 후 2시간, 4시간 또는 6시간 동안 배양합니다. 배양 후 소량의 액적을 현미경 슬라이드로 옮깁니다.
적절한 레이저 및 필터 구성의 표준 형광 현미경을 사용하여 명시야 및 형광 현미경으로 액적을 분석합니다. 오버레이 매체에 각 액적 샘플을 재현탁합니다. 재현탁된 샘플을 5ml FAC 튜브로 옮깁니다.
표준 유세포 분석기로 액적을 분석합니다. 전방 산란(forward scatter), 측면 산란(side scatter) 및 검사된 형광단(fluorophores)에 대한 강도 높이 신호를 기록합니다. 샘플 주입 포트를 통해 유세포 분석기를 세척하고, 각 액적 획득 세트 후에 표준 세척 및 헹굼 용액을 사용합니다.
CAR T 세포는 항 NGFR 자기 비드를 사용하여 두 공여자에 대해 98% 이상의 순도로 성공적으로 농축되었으며 CD4-CD8 비율은 순진한 유사 메모리 표현형이 관찰되어 0.73으로 정량화되었습니다. 비형질도입 T 세포를 실험에서 대조군으로 사용했습니다. 배양 4시간 후 실시한 형광 현미경 검사에서는 CAR T 세포와 함께 캡슐화된 JeKo-1 세포가 있는 액적에서 Granzyme B 분비가 관찰된 반면, 비형질 주입 T 세포에서는 분비가 검출되지 않았습니다.
유세포 분석은 캡슐화된 세포 유형을 기반으로 뚜렷한 액적 집단을 식별하여 CAR T 세포 및 JeKo-1 표적 세포를 포함하는 액적에서 뚜렷한 Granzyme B 분비 및 세포 독성 활성이 발생했음을 확인했습니다. CAR T세포에 의한 그란자임 B 분비 및 표적세포 사멸은 6시간 후 그란자임 B를 분비하는 CAR T세포의 30% 이상과 프로피듐 요오드화물 양성에서 알 수 있듯이 표적세포를 사멸하는 CAR T세포의 20% 이상으로 시간 의존적 증가를 보였다.
