私たちの研究は、単一エフェクターCAR-T細胞を標的細胞にカプセル化することにより、CAR-T細胞の機能的多様性を評価し、単一細胞レベルでの細胞毒性の可能性をよりよく理解することに焦点を当てています。現在の細胞毒性アッセイは、バルクで実施されることが多いため、制限されています。これでは、個々のCAR-T細胞間の違いが見落とされ、標的に対する応答が異なる異なる亜集団を同定できません。
当社の技術は、標準的なフローサイトメーターと細胞オーダーを使用して、単一細胞フォーマットでのマルチプレックス細胞死殺アッセイを可能にします。これにより、隣接するセルからの干渉がないため、バルクプロトコルよりも正確な結果が得られます。この種の研究により、私たちや他の科学者がCARのより詳細な情報や、CARがシングルセルレベルでどのように機能するかをより詳しく調べることができるようになることを願っています。
まず、2つの蛍光色素のストック溶液をDulbeccoのPBSで1:5, 000の比率で希釈します。細胞を別々の15ミリリットルチューブに移します。チューブを300gで5分間遠心分離します。
上清を取り除き、エフェクター細胞ペレットをバイオレット蛍光色素の作動溶液に再懸濁します。標的細胞ペレットを遠赤色蛍光色素の作動溶液に再懸濁します。染色した細胞を摂氏37度の加湿二酸化炭素インキュベーターで20分間インキュベートします。
インキュベーション後、細胞を300gで5分間遠心分離し、ペレット化します。細胞ペレットを15ミリリットルの完全RPMI 1640培地に再懸濁して洗浄します。再度洗浄して遠心分離します。
次に、上清を除去し、エフェクター細胞ペレットを225マイクロリットルの完全RPMI 1640培地に再懸濁し、標的細胞ペレットを450マイクロリットルの同じ培地に再懸濁します。エフェクター細胞懸濁液に30マイクロリットルの勾配培地を添加し、標的細胞懸濁液に60マイクロリットルを添加します。ピペッティングする前に、グラジエント培地ストック溶液を十分に混合してください。
次に、Granzyme B 基質ストックを完全な RPMI 1640 培地で事前に希釈します。ヨウ化ペリジウムストック溶液と希釈したグランザイムB基質をエフェクター細胞懸濁液および標的細胞懸濁液にピペットで移します。次に、ピペットで溶液をよく混合します。
細胞をカプセル化するには、カプセル化カートリッジと安定化溶液を室温に予熱します。完全なRPMI 1640培地、細胞用33%安定化溶液、および10%グラジエント培地を添加します。そして、それらを混ぜて外側の培地のストックを準備します。
各カプセル化サンプルについて、調製したエフェクター細胞懸濁液65マイクロリットルと調製した標的細胞懸濁液65マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに混合します。ピペットで細胞をよく再懸濁します。カプセル化カートリッジの指定されたウェルに、指定された順序で試薬をロードします。
リースは、ロードの直前にピペットで細胞をしっかりと懸濁します。ガスケットをカートリッジに慎重に密封します。カートリッジをマイクロ流体デバイスに移し、ユーザーマニュアルに従ってカプセル化を開始します。
ランが完了したら、カートリッジを取り外し、液滴をオーバーレイ培地に再懸濁し、蓋付きの2ミリリットルのDNA低結合チューブに移すことにより、ウェルDから液滴を回収します。ウェルAから残ったアウターメディウムでウェルDを洗い、残った液滴を回収します。液滴が収集チューブ内に沈殿したら、顕微鏡検査の前にチューブ内の2つの明確に異なる相を確認します。
10マイクロリットルのピペットチップの約3分の1を液滴層の表面からの液滴で満たします。次に、ピペットチップの残りの約3分の2にオーバーレイメディアを充填します。すぐにサンプルを8チャンバーのスライドガラスにロードします。
液滴を4倍および20倍の倍率で顕微鏡で観察し、細胞に液滴がロードされていることを確認します。インキュベーションには、21ゲージのシリンジ針を使用して、必要な数の2ミリリットルDNA低結合チューブの蓋に慎重に穴を開けます。各インキュベーションチューブに1ミリリットルの外部培地を追加します。
重ね合わせ培地に生成された液滴を再懸濁し、各プロダクションを調製した3つのインキュベーションチューブに分割します。液滴生成後、チューブをインキュベーターに直立させて2時間、4時間、または6時間インキュベートします。インキュベーション後、少量の液滴を顕微鏡スライドに移します。
適切なレーザーとフィルター構成の標準的な蛍光顕微鏡を使用して、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡で液滴を分析します。各液滴サンプルを重ね合わせ培地に再懸濁します。再懸濁したサンプルを5ミリリットルのFACチューブに移します。
標準的なフローサイトメーターで液滴を分析します。前方散乱光、側方散乱光、および検査した蛍光色素の強度高さ信号を記録します。サンプル注入ポートからフローサイトメーターを洗浄します 液滴取得の各セットの後、標準の清浄およびリンス溶液を使用します。
CAR-T細胞は、抗NGFR磁気ビーズを使用して、両方のドナーに対して98%を超える純度まで濃縮することに成功し、それらのCD4-CD8比は0.73で定量化され、ナイーブな記憶表現型が観察されました。実験では、形質導入されていないT細胞をコントロールとして使用しました。インキュベーションの4時間後の蛍光顕微鏡法では、CAR-T細胞と共カプセル化されたJeKo-1細胞の液滴中にGranzyme Bの分泌が認められましたが、形質導入されていないT細胞では分泌物は検出されませんでした。
フローサイトメトリーは、カプセル化された細胞タイプに基づいて異なる液滴集団を同定し、CAR T細胞とJeKo-1標的細胞を含む液滴で顕著なグランザイムB分泌と細胞傷害活性が発生したことを確認しました。CAR-T細胞によるグランザイムBの分泌と標的細胞の死滅は、6時間後に30%以上のCAR-T細胞がグランザイムBを分泌し、ヨウ化プロピジウム陽性が示すように、20%以上のCAR-T細胞が標的細胞を殺傷するなど、時間依存的な増加を示しました。
