בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

המחקר שלנו מתמקד בהערכת המגוון התפקודי של תאי CAR T על ידי עטיפת תאי CAR T אפקטורים בודדים עם תאי מטרה כדי להבין טוב יותר את הפוטנציאל הציטוטוקסי שלהם ברמת התא הבודד. בדיקות הציטוטוקסיות הנוכחיות מוגבלות מכיוון שהן מבוצעות לעתים קרובות בכמויות גדולות. זה מתעלם מהבדלים בין תאי T בודדים של CAR ואינו מצליח לזהות תת-אוכלוסיות מובחנות עם תגובות שונות למטרות.

הטכנולוגיה שלנו מאפשרת מבחני הריגת תאים מרובים בפורמט תא בודד באמצעות ציטומטרים סטנדרטיים של זרימה וסדר תאים. זה נותן תוצאות מדויקות יותר מאשר פרוטוקולים בתפזורת, מכיוון שאין הפרעה מהתאים השכנים. אנו מקווים שסוג זה של מחקר יאפשר לנו ולמדענים אחרים לבחון טוב יותר את הפרטים העדינים יותר של ה-CARs שלנו וכיצד הם מתפקדים ברמת התא הבודד.

כדי להתחיל, יש לדלל תמיסות מלאי של שני צבעים פלואורסצנטיים ביחס של 1:5,000 ב-PBS של Dulbecco. העבירו את התאים לצינורות נפרדים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות בחום של 300 גרם למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדורי תאי האפקטור בתמיסת העבודה של הצבע הפלואורסצנטי הסגול. השעו מחדש את כדורי תאי המטרה בתמיסת העבודה של הצבע הפלואורסצנטי האדום הרחוק. דגרו את התאים המוכתמים למשך 20 דקות בחממת פחמן דו חמצני לח של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות כדי לגלול אותם. השעו מחדש את כדורי התא ב -15 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שלם כדי לשטוף אותם. שוטפים וצנטריפוגה שוב.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדורי תאי האפקטור ב-225 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640 שלם ואת כדורי תאי המטרה ב-450 מיקרוליטר של אותו מדיום. הוסף 30 מיקרוליטר של מדיום שיפוע למתלי תאי האפקטור ו-60 מיקרוליטר למתלי תאי המטרה. מערבבים היטב את תמיסת הציר הבינוני של השיפוע לפני הפיפטה.

לאחר מכן, יש לדלל מראש את מלאי המצע של Granzyme B עם מדיום RPMI 1640 מלא. תמיסת מלאי יודיד פרידיום פיפטה ומצע Granzyme B מדולל לתרחיפים של תאי האפקטור ולמתלי תאי המטרה. ואז פיפטה כדי לערבב היטב את התמיסות.

כדי לעטוף את התאים, יש לחמם מראש את מחסנית האנקפסולציה ואת התמיסה המייצבת לטמפרטורת החדר. הוסף RPMI 1640 בינוני מלא 33% תמיסה מייצבת לתאים ומדיום שיפוע 10%. ומערבבים אותם להכנת ציר של מדיום חיצוני.

עבור כל דגימת אנקפסולציה, מערבבים 65 מיקרוליטר של תרחיף תאי אפקטור מוכן עם 65 מיקרוליטר של תרחיף תאי מטרה מוכן בצינור של 1.5 מיליליטר. השעו את התאים היטב בעזרת פיפטה. טען את הבארות המצוינות של מחסנית האנקפסולציה עם ריאגנטים בסדר הנתון.

ריס תולה תאים היטב עם פיפטה ממש לפני הטעינה. אטום את האטם בזהירות על המחסנית. העבר את המחסנית למכשיר המיקרופלואידיקה, ולאחר מכן התחל באנקפסולציה לפי המדריך למשתמש.

לאחר השלמת הריצה, הסר את המחסנית וקצור את הטיפות מבאר D על ידי השעייתן מחדש בתווך הכיסוי והעברתן לצינור קשירה נמוך של שני מיליליטר DNA עם מכסה. שוטפים היטב D עם המדיום החיצוני שנותר מבאר A כדי לאסוף את הטיפות הנותרות. כאשר הטיפות שקעו בצינורות האיסוף, אשר שני שלבים ברורים בצינורות לפני בדיקה מיקרוסקופית.

מלאו כשליש מקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בטיפות מפני השטח של שכבת הטיפות. לאחר מכן מלאו את כשני השלישים הנותרים של קצה הפיפטה באמצעי הכיסוי. טען מיד את הדגימה על שקופית זכוכית בעלת שמונה חדרים.

בדוק את הטיפות באופן מיקרוסקופי בהגדלה של פי 4 ו-20x כדי לאשר העמסת טיפות בתאים. לצורך הדגירה, השתמש במחט מזרק בגודל 21 כדי לנקב בזהירות את המכסה של המספר הנדרש של שני צינורות קשירה נמוכים של שני מיליליטר DNA. הוסף מיליליטר אחד של מדיום חיצוני לכל צינור דגירה.

השעו מחדש את הטיפות שנוצרו במצע הכיסוי ופצלו כל ייצור לשלושה צינורות דגירה מוכנים. הנח את הצינורות זקופים בחממה למשך שעתיים, ארבע או שש שעות של דגירה לאחר יצירת הטיפות. לאחר הדגירה, העבירו מספר קטן של טיפות לשקופית מיקרוסקופ.

נתח את הטיפות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר ופלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי עם תצורת לייזר ומסנן מתאימה. השעו מחדש כל דגימת טיפה במדיום הכיסוי. העבר את הדגימות התלויות לצינורות FAC של חמישה מיליליטר.

נתח את הטיפות בעזרת ציטומטר זרימה סטנדרטי. רשום אותות גובה עוצמה עבור פיזור קדימה, פיזור צד והפלואורופורים שנבדקו. שטפו את ציטומטר הזרימה דרך יציאת הזרקת הדגימה לאחר כל סט של רכישת טיפות באמצעות תמיסות ניקוי ושטיפה סטנדרטיות.

תאי T של CAR הועשרו בהצלחה לטוהר של למעלה מ-98% עבור שני התורמים באמצעות חרוזים מגנטיים נגד NGFR ויחס CD4-CD8 שלהם כומת ב-0.73 עם פנוטיפ זיכרון נאיבי שנצפה. תאי T שאינם מתמרים שימשו כבקרות בניסוי. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר ארבע שעות דגירה הדגימה הפרשת גרנזים B בטיפות עם תאי JeKo-1 עטופים בתאי T CAR בעוד שלא זוהתה הפרשה עם תאי T שאינם מתמרים.

ציטומטריית זרימה זיהתה אוכלוסיות טיפות מובחנות על סמך סוגי תאים עטופים, ואישרה כי הפרשת גרנזים B בולטת ופעילות ציטוטוקסית התרחשו בטיפות המכילות תאי CAR T ותאי מטרה JeKo-1. הפרשת גרנזים B והרג תאי מטרה על ידי תאי T של CAR הראו עלייה תלוית זמן עם יותר מ-30% תאי T של CAR המפרישים גרנזים B לאחר שש שעות ויותר מ-20% מתאי ה-T של CAR הרגו תאי מטרה כפי שמצוין על ידי חיובי פרופידיום יודיד.