我们的研究重点是通过将单效应 CAR T 细胞与靶细胞封装来评估 CAR T 细胞的功能多样性，以更好地了解它们在单细胞水平上的细胞毒性潜力。目前的细胞毒性检测是有限的，因为它们通常是批量进行的。这忽略了单个 CAR T 细胞之间的差异，并且无法识别对靶标具有不同反应的不同亚群。
我们的技术能够使用标准流式细胞仪和细胞顺序进行单细胞形式的多重细胞杀伤检测。这比批量协议提供更精确的结果，因为没有来自相邻单元的干扰。我们希望这种类型的研究将使我们和其他科学家能够更好地检查我们的 CAR 的更精细细节以及它们在单细胞水平上的作用。
首先，在 Dulbecco 的 PBS 中以 1：5， 000 的比例稀释两种荧光染料的储备溶液。将细胞转移到单独的 15 ml 试管中。将试管以 300 g 离心 5 分钟。
去除上清液，将效应细胞沉淀重悬于紫色荧光染料的工作溶液中。将靶细胞沉淀重悬于远红荧光染料的工作溶液中。将染色的细胞在 37 摄氏度加湿二氧化碳培养箱中孵育 20 分钟。
孵育后，将细胞以 300 g 离心 5 分钟以使其沉淀。将细胞沉淀重悬于 15 mL RPMI 1640 完全培养基中以洗涤它们。再次洗涤并离心。
然后去除上清液，将效应细胞沉淀重悬于 225 μL 完全 RPMI 1640 培养基中，将靶细胞沉淀重悬于 450 μL 相同培养基中。向效应细胞悬液中加入 30 μL 梯度培养基，向目标细胞悬液中加入 60 μL。移液前充分混合梯度培养基储备液。
接下来，用完整的 RPMI 1640 培养基预稀释 Granzyme B 底物储备液。吸取碘哌哌储备液和稀释的颗粒酶 B 底物到效应细胞悬液和靶细胞悬液中。然后移液以充分混合溶液。
要封装细胞，请将封装盒和稳定溶液预热至室温。加入完整的 RPMI 1640 培养基、33% 细胞稳定溶液和 10% 梯度培养基。并将它们混合以制备外层培养基。
对于每个包埋样品，将 65 微升制备的效应细胞悬液与 65 微升制备的靶细胞悬液混合在 1.5 毫升试管中。用移液管充分重悬细胞。按给定顺序用试剂加载封装柱的指定孔。
Reese 在加载前用移液管将细胞充分悬浮。小心地将垫圈密封到墨盒上。将卡盒转移到微流体装置，然后按照用户手册开始封装。
运行完成后，取出小柱，将液滴重悬于覆盖培养基中，并转移至 2 mL DNA 低结合管中，带盖，从 D 孔中收获液滴。用 A 孔中剩余的外部培养基洗涤 D 孔，以收集剩余的液滴。当液滴在收集管中沉淀时，在显微镜检查之前确认管中有两个明显不同的阶段。
用液滴层表面的液滴填充 10 微升移液器吸头的大约三分之一。然后用叠加介质填充移液器吸头的剩余约三分之二。立即将样品加载到八腔载玻片上。
以 4 倍和 20 倍放大倍率在显微镜下检查液滴，以确认细胞中的液滴负载。孵育时，使用 21 号注射器针头小心地刺穿所需数量的 2 mL DNA 低结合管的盖子。向每个孵育管中加入 1 mL 外层培养基。
重悬叠加培养基中产生的液滴，并将每种产品分成三个准备好的孵育管中。在液滴生成后，将试管直立放置在培养箱中孵育 2 小时、4 小时或 6 小时。孵育后，将少量液滴转移到显微镜载玻片上。
使用具有适当激光和滤光片配置的标准荧光显微镜，通过明场和荧光显微镜分析液滴。将每个液滴样品重悬于叠加培养基中。将重悬样品转移到 5 mL FAC 管中。
使用标准流式细胞仪分析液滴。记录前向散射、侧向散射和检查的荧光团的强度高度信号。使用标准清洁和冲洗溶液进行每组液滴采集后，通过样品进样口清洗流式细胞仪。
使用抗 NGFR 磁珠成功将两个供体的 CAR T 细胞富集至纯度超过 98%，并且它们的 CD4-CD8 比率定量为 0.73，观察到幼稚样记忆表型。未转导的 T 细胞在实验中用作对照。孵育 4 小时后的荧光显微镜显示，与 CAR T 细胞共封装的 JeKo-1 细胞在液滴中分泌颗粒酶 B，而未转导的 T 细胞未检测到分泌。
流式细胞术根据封装的细胞类型鉴定了不同的液滴群，证实了在含有 CAR T 细胞和 JeKo-1 靶细胞的液滴中发生了明显的颗粒酶 B 分泌和细胞毒活性。颗粒酶 B 分泌和 CAR T 细胞对靶细胞的杀伤表现出时间依赖性增加，超过 30% 的 CAR T 细胞在 6 小时后分泌颗粒酶 B，超过 20% 的 CAR T 细胞杀死靶细胞，如碘化丙啶阳性所示。
