La nostra ricerca si concentra sulla valutazione della diversità funzionale delle cellule T CAR incapsulando singole cellule T effettrici con cellule bersaglio per comprendere meglio il loro potenziale citotossico a livello di singola cellula. Gli attuali saggi di citotossicità sono limitati perché spesso vengono eseguiti in blocco. Questo trascura le differenze tra le singole cellule T CAR e non riesce a identificare sottopopolazioni distinte con risposte variabili ai bersagli.
La nostra tecnologia consente di eseguire saggi multiplex di uccisione cellulare in un formato a singola cellula utilizzando citometri a flusso standard e ordini di cellule. Questo fornisce risultati più precisi rispetto ai protocolli di massa, poiché non vi è alcuna interferenza da parte delle celle vicine. Speriamo che questo tipo di ricerca permetta a noi e ad altri scienziati di esaminare meglio i dettagli più fini dei nostri CAR e come funzionano a livello di singola cellula.
Per iniziare, diluire le soluzioni stock di due coloranti fluorescenti in un rapporto 1:5.000 nel PBS di Dulbecco. Trasferire le cellule in provette separate da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 300 g per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet di cellule effettrici nella soluzione di lavoro del colorante fluorescente viola. Risospendere i pellet della cellula bersaglio nella soluzione di lavoro del colorante fluorescente rosso lontano. Incubare le cellule colorate per 20 minuti in un incubatore ad anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti per pellettizzarle. Risospendere i pellet di cella in 15 millilitri di terreno RPMI 1640 completo per lavarli. Lavare e centrifugare nuovamente.
Quindi rimuovere il surnatante e risospendere i pellet di cellule effettrici in 225 microlitri di terreno RPMI 1640 completo e i pellet di cellule target in 450 microlitri dello stesso terreno. Aggiungere 30 microlitri di un mezzo gradiente alle sospensioni cellulari effettrici e 60 microlitri alle sospensioni cellulari target. Miscelare bene la soluzione madre del terreno sfumato prima del pipettaggio.
Successivamente, pre-diluire il substrato Granzyme B con un terreno RPMI 1640 completo. Pipettare la soluzione madre di ioduro di peridio e il substrato diluito di Granzyme B nelle sospensioni di cellule effettrici e nelle sospensioni di cellule bersaglio. Quindi pipettare per mescolare bene le soluzioni.
Per incapsulare le celle, preriscaldare la cartuccia di incapsulamento e la soluzione stabilizzante a temperatura ambiente. Aggiungere il terreno RPMI 1640 completo Soluzione stabilizzante al 33% per le cellule e il terreno a gradiente al 10%. E mescolateli per preparare una scorta di terreno esterno.
Per ogni campione di incapsulamento, mescolare 65 microlitri di sospensione di cellule effettrici preparate con 65 microlitri di sospensione di cellule bersaglio preparate in una provetta da 1,5 millilitri. Risospendere bene le cellule con una pipetta. Caricare i pozzetti indicati della cartuccia di incapsulamento con i reagenti nell'ordine indicato.
Reese sospende bene le cellule con una pipetta subito prima del caricamento. Sigillare accuratamente la guarnizione sulla cartuccia. Trasferire la cartuccia nel dispositivo microfluidico, quindi avviare l'incapsulamento come da manuale utente.
Al termine della corsa, rimuovere la cartuccia e raccogliere le goccioline dal pozzetto D risospendendole nel mezzo di sovrapposizione e trasferendole in una provetta da due millilitri di DNA a basso legame con coperchio. Lavare bene D con il mezzo esterno rimanente dal pozzetto A per raccogliere le goccioline rimanenti. Quando le goccioline si sono sedimentate nelle provette di raccolta, confermare due fasi chiaramente distinte nelle provette prima dell'esame microscopico.
Riempire circa un terzo del puntale di una pipetta da 10 microlitri con le goccioline dalla superficie dello strato di goccioline. Quindi riempire i restanti due terzi circa del puntale della pipetta con il terreno di rivestimento. Caricare immediatamente il campione su un vetrino a otto camere.
Esaminare le goccioline al microscopio con un ingrandimento di 4x e 20x per confermare il carico delle goccioline con le cellule. Per l'incubazione, utilizzare un ago per siringa calibro 21 per perforare con cura il coperchio del numero richiesto di provette a basso legame di DNA da due millilitri. Aggiungere un millilitro di terreno esterno a ciascuna provetta di incubazione.
Risospendere le goccioline generate nel terreno di copertura e dividere ogni produzione in tre provette di incubazione preparate. Posizionare le provette in posizione verticale nell'incubatore per due, quattro o sei ore di incubazione dopo la generazione di goccioline. Dopo l'incubazione, trasferire un piccolo numero di goccioline su un vetrino da microscopio.
Analizza le goccioline mediante microscopia a campo chiaro e a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza standard con configurazione laser e filtro appropriata. Risospendere ogni campione di goccioline nel mezzo di sovrapposizione. Trasferire i campioni risospesi in provette FAC da cinque millilitri.
Analizzare le goccioline con un citometro a flusso standard. Registra i segnali di intensità e altezza per la diffusione diretta, la dispersione laterale e i fluorofori esaminati. Lavare il citometro a flusso attraverso la porta di iniezione del campione Dopo ogni serie di acquisizioni di goccioline utilizzando soluzioni standard di pulizia e risciacquo.
Le cellule T CAR sono state arricchite con successo a una purezza superiore al 98% per entrambi i donatori utilizzando biglie magnetiche anti NGFR e il loro rapporto CD4-CD8 è stato quantificato a 0,73 con un fenotipo di memoria simile a quello naive osservato. Le cellule T non trasdotte sono state utilizzate come controlli nell'esperimento. La microscopia a fluorescenza dopo quattro ore di incubazione ha dimostrato la secrezione di Granzyme B nelle goccioline con cellule JeKo-1 coincapsulate con cellule T CAR, mentre nessuna secrezione è stata rilevata con le cellule T non trasdotte.
La citometria a flusso ha identificato popolazioni di goccioline distinte in base ai tipi di cellule incapsulate, confermando che la secrezione pronunciata di Granzyme B e l'attività citotossica si sono verificate nelle goccioline contenenti cellule T CAR e cellule bersaglio JeKo-1. La secrezione di granzima B e l'uccisione delle cellule bersaglio da parte delle cellule T CAR hanno mostrato un aumento dipendente dal tempo con oltre il 30% delle cellule T CAR che secernono il granzima B dopo sei ore e oltre il 20% delle cellule T CAR che uccidono le cellule bersaglio, come indicato dalla positività allo ioduro di propidio.
