Nuestra investigación se centra en evaluar la diversidad funcional de las células CAR-T mediante el encapsulamiento de células CAR-T efectoras individuales con células diana para comprender mejor su potencial citotóxico a nivel de una sola célula. Los ensayos de citotoxicidad actuales son limitados porque a menudo se realizan a granel. Esto pasa por alto las diferencias entre las células T con CAR individuales y no identifica subpoblaciones distintas con diferentes respuestas a los objetivos.
Nuestra tecnología permite ensayos de matanza celular multiplex en un formato de una sola célula utilizando citómetros de flujo estándar y órdenes de células. Esto proporciona resultados más precisos que los protocolos masivos, ya que no hay interferencia de las celdas vecinas. Esperamos que este tipo de investigación nos permita a nosotros y a otros científicos examinar mejor los detalles más finos de nuestros CAR y cómo funcionan a nivel de una sola célula.
Para empezar, diluya las soluciones madre de dos colorantes fluorescentes en una proporción de 1:5.000 en el PBS de Dulbecco. Transfiera las celdas a tubos separados de 15 mililitros. Centrifugar los tubos a 300 g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos de células efectoras en la solución de trabajo del tinte fluorescente violeta. Vuelva a suspender los gránulos de la célula objetivo en la solución de trabajo del tinte fluorescente rojo lejano. Incubar las células teñidas durante 20 minutos en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos para peletizarlas. Vuelva a suspender los pellets de celda en 15 mililitros de medio RPMI 1640 completo para lavarlos. Lavar y centrifugar de nuevo.
A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos de la célula efectora en 225 microlitros de medio RPMI 1640 completo y los gránulos de la célula objetivo en 450 microlitros del mismo medio. Agregue 30 microlitros de un medio de gradiente a las suspensiones de células efectoras y 60 microlitros a las suspensiones de células objetivo. Mezcle bien la solución madre del medio degradado antes de pipetar.
A continuación, diluya previamente el sustrato Granzyme B con el medio RPMI 1640 completo. Pipetear la solución madre de yoduro de peridio y el sustrato Granzyme B diluido en las suspensiones de células efectoras y en las suspensiones de células diana. A continuación, pipetea para mezclar bien las soluciones.
Para encapsular las celdas, precaliente el cartucho de encapsulación y la solución estabilizadora a temperatura ambiente. Agregue medio RPMI 1640 completo, solución estabilizadora al 33% para celdas y medio con gradiente al 10%. Y mezclarlos para preparar un caldo de medio exterior.
Para cada muestra de encapsulación, mezcle 65 microlitros de suspensión de células efectoras preparadas con 65 microlitros de suspensión de células diana preparadas en un tubo de 1,5 mililitros. Vuelva a suspender bien las células con una pipeta. Cargue los pocillos indicados del cartucho de encapsulación con reactivos en el orden indicado.
Reese suspende bien las células con una pipeta justo antes de cargarlas. Selle la junta con cuidado en el cartucho. Transfiera el cartucho al dispositivo de microfluídica, luego inicie la encapsulación según el manual del usuario.
Una vez completada la ejecución, retire el cartucho y recoja las gotas del pozo D resuspendiéndolas en el medio de recubrimiento y transfiriéndolas a un tubo de baja unión de ADN de dos mililitros con tapa. Lave el pocillo D con el medio exterior restante del pocillo A para recoger las gotas restantes. Cuando las gotas se hayan sedimentado en los tubos de recolección, confirme dos fases claramente distintas en los tubos antes del examen microscópico.
Llene aproximadamente un tercio de la punta de una pipeta de 10 microlitros con gotas de la superficie de la capa de gotas. A continuación, rellene los dos tercios restantes de la punta de la pipeta con el medio de superposición. Cargue inmediatamente la muestra en un portaobjetos de vidrio de ocho cámaras.
Examine las gotas microscópicamente con aumentos de 4x y 20x para confirmar la carga de gotas con las células. Para la incubación, use una aguja de jeringa de calibre 21 para perforar cuidadosamente la tapa del número requerido de dos tubos de unión baja de ADN de mililitros. Agregue un mililitro de medio exterior a cada tubo de incubación.
Vuelva a suspender las gotas generadas en el medio de superposición y divida cada producción en tres tubos de incubación preparados. Coloque los tubos en posición vertical en la incubadora durante dos, cuatro o seis horas de incubación después de la generación de gotas. Después de la incubación, transfiera una pequeña cantidad de gotas a un portaobjetos de microscopio.
Analice las gotas mediante microscopía de campo claro y fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia estándar con la configuración adecuada de láser y filtro. Vuelva a suspender cada muestra de gota en el medio de recubrimiento. Transfiera las muestras resuspendidas a tubos FAC de cinco mililitros.
Analice las gotas con un citómetro de flujo estándar. Registre las señales de altura de intensidad para la dispersión directa, la dispersión lateral y los fluoróforos examinados. Lave el citómetro de flujo a través del puerto de inyección de muestras después de cada serie de adquisiciones de gotas utilizando soluciones estándar de limpieza y enjuague.
Las células CAR-T se enriquecieron con éxito a una pureza de más del 98% para ambos donantes utilizando perlas magnéticas anti NGFR y su relación CD4-CD8 se cuantificó en 0,73 con un fenotipo de memoria ingenuo observado. En el experimento se utilizaron células T no transducidas como controles. La microscopía de fluorescencia después de cuatro horas de incubación demostró la secreción de Granzima B en gotitas con células JeKo-1 coencapsuladas con células T con CAR, mientras que no se detectó ninguna secreción con células T no transducidas.
La citometría de flujo identificó distintas poblaciones de gotas en función de los tipos de células encapsuladas, lo que confirma que se produjo una secreción pronunciada de Granzima B y actividad citotóxica en las gotas que contenían células CAR-T y células diana JeKo-1. La secreción de granzima B y la destrucción de las células diana por las células T con CAR mostraron un aumento dependiente del tiempo, con más del 30% de las células T con CAR que secretan Granzyme B después de seis horas y más del 20% de las células T con CAR que matan a las células diana, como lo indica la positividad del yoduro de propidio.
