우리는 휴대 전화 응용 프로그램에 대한 유익한 토론을 계속하기위한 로랑 Limozin, 피에르 딜라드와 아스트리드 월합니다. 우리는 또한 SEM 관찰 그의 도움을 PLANETE 클린 룸 시설에서 프레데릭 베두합니다. 이 작품은 부분적으로 허가 번호 307104 FP / 2007년부터 2013년까지 / ERC를 통해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.

1. 청소 유리 커버 - 슬라이드와 관측 챔버 <ol><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)와 같은 불활성 물질로 이루어진 멀티 슬라이드 트레이 유리 커버 슬라이드 배열. </li><li> 계면 활성제 용액 슬라이드 트레이 및 관찰 챔버 (적합한 석영 큐벳을 세정 추천 어떤 제품)을 담근다. </li><li> (20, 30 ° C 사이)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액을 초음파 욕 울트라 초음파 처리를 사용. </li><li> 초순수로 5 회 (18.2 MΩ.cm, 0.059 μS / cm)을 헹군다. </li><li> (20, 30 ° C 사이의)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액 울트라 초음파 처리. </li><li> 초순수로 10 회를 씻어. </li><li> 반복 두 번 1.5 및 1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 최대 1 주일 동안 실온 (20 ° ~ 30 C) 물에 보관할 것. </li></ol> 단백질 나노 점의 2 제작 <ol><li> 구슬의 증착 <ol><li> Deposit 15 °의 경사각으로 유지 (170 μm의 두께를 24 X 24mm) 실리카 비드 (2 % V / V를 70 μL) 은폐 슬라이드 적가의 현탁액. </li><li> 90 °마다 15 초에 의해 유리를 틀지 동안 정지가 약 1 분간 확산 보자. </li><li> 액체가 주위 조건하에 증발 할 수있다. </li><li> 최대 2 일 동안 주위 조건에서 깨끗한 유리 또는 PTFE 실에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 알루미늄 증착 <ol><li> 알루미늄 (99 %)에서 약 105 mm의 거리에서 회전 테이블 (RF) 마그네트론 스퍼터링 장치 (8), 무선 주파수 내부 슬라이드 (섹션 2.1에서 제조)를 넣 실리콘 (1 %) 타겟. </li><li> 터보 분자 펌프를 이용하여 2.6 × 10 -4 파에 상기 증착 챔버를 펌프 다운. 이 단계는 가능한 기체 불순물의 제거를 위해 중요하다. </li><li> 0.8 파 (6.6 mTorr 이하)의 압력에서 10 sccm의 유량으로 순수 아르곤 분위기 (5N, 99.999 %)를 소개한다. <br/&gt; 주 : 수신 아르곤 유속은 질량 유량 제어기에 의해 제어되며, 프로세스 압력은 압력 게이지를 사용하여 모니터된다. 아르곤 가스의 유량은 연속적이며, 입구 및 출구 밸브의 개방 사이의 균형에 의해 제어된다. </li><li> RF 전력 생성기에 스위치. 주 : 여기에서, 13.56 MHz의 주파수에서 400 내지 600 W의 고주파 전력의 전형적인 범위를 사용 하였다. 상기 RF 발생기는 용량 성 결합 플라즈마 모드의 매칭 네트워크와 함께 사용된다. 반사 전력을 모니터링하고 네트워크를 이용하여 적응 최소화된다. </li><li> 상기 플라즈마가 안정화 된 후에, 2 분의 타겟 표면에서 가능한 불순물을 제거하기 위해 셔터가 닫힌 상태를 유지하기위한 스퍼터. </li><li> 셔터를 열어 60 분, 200 nm의 두께로 유리 슬라이드에 알루미늄을 증착하기 위해 스퍼터링을 계속 할 수있다. </li><li> 아르곤의 유동을 차단 증착 챔버로부터 터보 분자 펌프를 격리하는 게이트 밸브를 폐쇄하고 깨끗한 N과 벤트 챔버itrogen 방 압력을 얻었다. 알루미늄 코팅 된 슬라이드를 복구. 한 달까지 주변 조건에서 깨끗하고 밀폐 된 유리 또는 PTFE 상자에 대한 보관하십시오. </li></ol></li><li> 유기 실란의 증기 증착 <ol><li> (20, 30 ° C 사이에 50 W, 50 ㎐,) 초음파 조에서 30 초 동안 실온 울트라 초음파 처리에 초순수의 단계 2.2.6에서 제조 한 알루미늄 - 코팅 슬라이드 담근다. </li><li> 건조기의 하단 (3- 아미노 프로필) -triethoxysilane (APTES) 0.5 mL를 입금. 주의 : APTES 쉽게 증발 독성 유기 실란이다. APTES에만 흐름 후드와 장갑으로 취급해야한다. </li><li> 데시 케이 터 내부의 세라믹 그리드와 장소에 (2.3.1 준비) 유리 슬라이드를 넣습니다. </li><li> 멤브레인 펌프에 연결하고, 데시 케이 터를 30 분은 저 진공을 발생하기위한 최대 전력에서 실행. </li><li> 데시 케이 터의 밸브를 닫고 펌프를 끕니다. </li><li> 데시 케이 터를 가열1 시간 동안 50 ° C이다. </li><li> 데시 케이 터를 열고 슬라이드를 수집합니다. </li><li> 실온에서 최대 48 시간 (20 ~ 30 ° C)에 대한 저장을 위해 다른 청정 건조기로 옮긴다. </li></ol></li><li> 단백질의 제 1 층의 증착 - 비오틴으로 표지 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴) <ol><li> PTFE를 지원에 2.3에서 제조 된 슬라이드 중 하나를 놓습니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해 된 25 ㎍ / ㎖의 BSA 비오틴 기탁 한 용액. 실온 (20 내지 30 °의 C)에서 30 분 동안 남겨. </li><li> PBS로 10 회를 씻어. 멀리 광원에서 4 ° C에서 최대 24 시간 동안 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 알루미늄 마스크를 제거하여 <ol><li> 상온 (20 ° C 내지 30)의 위에 박 (pH≈12을 수득 약 100 ㎖의 PBS에 1 M NaOH를 적가하여 제조) PBS 중의 NaOH의 용액에 슬라이드를 인큐베이션. 주의. NaOH를 부식 및 장갑을 사용하여 처리해야한다. </li><li> 헹구기초순수의 10 배. </li></ol></li></ol> 지원되는 지질 이중층 3. 증착 (SLB) <ol><li> 랭 뮤어 통을 청소 <ol><li> 펌프를 사용하여 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저에서 물을 제거합니다. </li><li> 클로로포름에 적신 보풀이없는 부직포 일회용 수건으로 닦으십시오. 주의. 클로로포름 독성 및 (또는 유동 후드) 마스크를 적절한 장갑, 통풍이 잘되는 곳에서 조작되어야한다. </li><li> 미지근한 초순수 (40 ~ 50 °의 C)와 4 번 면도. </li><li> 차가운 초순수 청소 적어도 6 회. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저 PTFE 트레이를 배치 한 후, 초순수로 채운다. </li><li> 0 mN의 / m로 측정 된 압력을 설정 랭 뮤어 장치의 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> (1 ㎎ / ㎖ 지질 용액 30 μL를 증착하는 제 1 기밀 유리 / 금속 주사기를 사용하여물 표면에 2 dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 클로로포름 (DOPC)). 클로로포름을 증발 지질 분자가 자발적으로 단층을 형성한다. </li><li> 도달 (DOPC 27 mN의 / m)을 원하는 압력까지 PTFE 배리어를 폐쇄함으로써 지질 단층을 압축하는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 전동 클램프를 사용하여 PTFE 인클로저에 섹션 2.5.2에서 제조 된 유리 슬라이드를 찍어 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 수직 한 공기 - 물 계면에, 상기 클램프에 슬라이드를 잡아. / m에서 27 mN의 일정 압력을 유지하면서, 인터페이스를 통해 천천히 (15mm / 분)을 올리는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 실온에서 최대 24 시간 (20 ° 내지 30 C) 중 하나를 즉시 사용 또는 저장을 위해 건조한 장소. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> / m 27 Mn의 목표 값에 랭 뮤어 통의 표면 압력을 유지한다. 를 사용하여 압축랭 뮤어 장치 및 / 또는 제어 소프트웨어가 원하는 압력을 달성하기 위해, 지질 소량의 추가. </li><li> 가로 물의 표면 섹션 3.2.6에서 제조 지질 단층을 운반하는 유리 슬라이드를 놓는다. 각 슬라이드는 PTFE 트레이 위에 떠있는 것을 확인. </li><li> 아래 유리 슬라이드를 넣거나, 이들은 물에 침지되도록 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용하여 해당 PTFE 트레이에 한 번에 하나 개의 슬라이드. 누른 상태에서 슬라이드를 기울 마십시오. </li><li> 초순수는 슬라이드가 공기에 노출되지 않도록 만드는 가득 정석으로 슬라이드를 포함하는 PTFE 트레이를 전송하는 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용합니다. </li><li> 관찰 챔버 내로, 이중층 코팅 된 유리 슬라이드를 수중 작업하는 동안, 전송 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용한다. 주 : 관찰 챔버는 결정 화기 내부에 물 아래에 배치됩니다. 관찰 챔버는 맞춤 제작 및 고무 가스켓기로와 PTFE 고리로 구성되는그 저면 이전 지질 이중층 코팅 유리 슬라이드로 만들어진다 수밀 챔버를 만들기 위해 수중 조립 될 수 D 스틸 케이스. </li><li> 물 속에 계속 작업 물 1 ㎖를 상기 챔버 내부에 포획되는 것을 보장하면서도 상기 챔버를 닫는다. </li><li> 물에서 조립 된 챔버를 가져 가라. 그것은 방수 및 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 추가 및 PBS 10 배의 500 μL를 제거하여 PBS로 관찰 챔버 내의 초순수 존재하는 1 mL로 대체. 챔버는 액체의 결코 찾아 볼 수없는 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> SLB 차단 단계 <ol><li> 섹션 3.3.6에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 관찰 챔버 내에 소 혈청 알부민 100 ㎍ / ㎖ (BSA)를 도입하고, 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 배양한다. </li><li> 제거하고 PBS 10 배의 500 μL를 첨가하여 이중층 린스. 이중층은 4 ℃에서 24 시간 동안 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 리간드 4. 기능화 <ol><li> 20 및 30 ℃ 사이의 실온에서 30 분 동안 섹션 3.4.2에서 제조 된 슬라이드 (함유하는 챔버로 2 ㎍ / ㎖의에 형광 비 형광 비딘을 (NAV 아비딘의 탈글 라이코 실화 된 버전의 pH를 7로 충전되지 않은) 추가 기음). </li><li> 첨가하고 10 배 PBS 500 μL를 제거하여 씻어. </li><li> 섹션 3.4.2에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 챔버에 2 ㎍ / ㎖의 비오틴 화 항에 CD3 추가. SLB와 도트의 이중 작용 들어, (여기서, 이중층는 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 지질의 + 1 % DOPC 이루어진다) 5 ㎍ / mL로하는 FC-ICAM1 그의 태그를 추가한다. 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 떠난다. </li><li> 10 회를 추가하고 PBS의 500 μL를 제거하여 헹구어 </li><li> 10 배 첨가하여 세포 배지 500 μL를 제거하여 세포 매체와 PBS (PBS + 0.1 % BSA)을 대체. </li><li> chambe에서 세포 매체의 200 μL를 남겨슬라이드와 r에. </li><li> 세포를 첨가하기 전에 37 ℃에서 10 분 동안 실을 놓는다. </li></ol> 5. 셀 증착 (자세한 내용은 문헌 7 참조) <ol><li> 조심스럽게 챔버에 세포 현탁액 400 μL 증착. 37 ° C에서 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 37 ° C에서 15 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정. 반복 제거하고 PBS 500 μL를 첨가하여 PBS와 함께 PFA를 교체합니다. </li></ol> 6. 관측 <ol><li> Proteo-지질 나노 패턴 및 SLB 유동성 <ol><li> BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 등 여기서, EX TBP 483 + 564 + 642 (적절한 조명 파장 (639 ㎚) 및 필터 큐브를 사용하여 이미지를 에피 형광 모드의 단백질 패턴을 형광 현미경을 사용하여 688). 주 : 신호의 강도는 내부 도트 외부 단백질의 양을 추정하기 위해 정량화 될 수있다. 적절한 조명 파장 (330 ㎚) 및 F를 사용하여이미지 ilter 큐브 어두운 구멍 밝다 이중층 (BP 12분의 365, FT (395), LP (397)). </li><li> 이중층의 트레이서 지질의 확산 상수를 측정하기 위해 연속 포토 블리치 (CPB)의 기술 (13), (15)를 사용한다. 이러한 결과는 바람직하게는 단지 SLB 증착 후에 이루어진다. 주 : 확산 상수를 정량화하기 위해, 두 개의 매개 변수가 CPB 공정 동안 측정된다 : 염료 (긴장) 및 표백 영역 (tauD) 주위에 형성된 할로 형광 프로파일의 붕괴 길이의 비 표백 시간. 첫번째는 CPB 공정 동안 조명 된 영역의 중심에서 형광 강도의 시간 변화를 플로팅함으로써 얻어진다. 두 번째는 (정상 상태에 도달 한 후 12 개 라인 5 개 이미지에 걸쳐 평균화)을 조사 영역의 에지의 강도 프로파일을 플로팅함으로써 얻어진다. 곡선은 팽팽하고 tauD을 얻었다 장착된다. 확산 상수 TA 주어진다UD 2 / 긴장된 (D = <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

전술 한 프로토콜 내에서 중요한 단계는 지원 지질 이중층에 의해 단백질 나노 점 또는 점 주위 공간의 백 필러의 형성에 관련이있다. 단백질 나노 도트에 대한 제 1 임계 단계 비드 마스크의 제조 방법이다. 커버 슬라이드의 청소가 중요합니다. 슬라이드 중 하나, 또는 산소 플라즈마로 석영 큐벳을 청소 추천 된 세제를 청소해야합니다. 에탄올 또는 이소프로판올의 치료와 같은 다른 침지 세정 ?...

<html> 세포 유착은 세포 외 기질 또는 다른 셀에 그들의 상대에 결합 할 수있는 세포막에 존재하는 전문 세포 부착 분자 (CAM들) 단백질을 통해 일어난다. 접착 된 세포에 편재하는 인테그린과 카데 포함한 대부분의 접착 분자, 클러스터 (1)의 형태로 제공된다. 항원 제시 세포와 T 림프구 (T 세포)의 작용 (장갑차)이 두 셀 사이의 인터페이스에서 형성 수용체 클러스터의 중요성은 특히 현저한 설명을 제공한다 - 종종 면역 시냅스했다. cSMAC (큰 중앙 초분자 클러스터를 형성하도록 플랫폼 (2), (3, 4)에게 시그널링 역할을하고, 최종적으로 집중되는 T 세포 형태 마이크론 스케일 클러스터의 표면상의 APC, T 세포 수용체 (TCR도)와 제 접촉을 형성하면 )아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 6, 7. 최근는 APC 측 것을 도시하고, TCR의 리간드는 또한 8 클러스터된다. 은 APC가 중요한 단백질 기능화 인공 표면에 의해 모방된다 T 세포 APC 상호 작용, 하이브리드 시스템의 배치의 상황에서, 시냅스 인터페이스 2, 3, 4, 5, 6, 7에 대한 이해를 전진 크게했다 . 이러한 맥락에서, 상기 타겟 셀의 하나 이상의 양상을 포착 APC 모방 표면을 설계하는 것이 매우 적합하다. 리간드가 지원되는 지질 이중층에 이식하는 경우 예를 들어, 그들은 이중층의 평면 확산은 APC 표면에 상황을 모방하고 동시에의 형성을 허용 할 수 있습니다cSMAC 6,7. 마찬가지로, APC의 클러스터는 중합체 9, 10, 11, 12, 13, 14의 바다 섬 리간드를 모방하여 생성되었다. 그러나 이러한 두 가지 기능은 지금까지 결합되지 않았다. 여기에서는 확산 지질과 지질 이중층으로 둘러싸인 항 CD3 (TCR의 복합체를 표적 항체)의 나노 도트를 생성하는 신규 한 기술을 설명한다. 이중층은 랭 뮤어 - 블로 젯 / 랭 뮤어 쉐퍼 기술 7, 15, 16을 이용하여 증착되고, 필요하다면, 특정 단백질로 작용 화 될 수있다 - 예를 들면, T 세포의 인테그린의 리간드 (ICAM1 불림). 또한, 항 CD3 단백질 도트를 기LD는 다른 항체 또는 CAM으로 대체 될 수있다. 우리는 T 세포 접착 연구를위한 플랫폼으로 향후 사용을 위해 단백질을 선택하고 있지만, 여기에 설명 된 전략은 어떤 ​​단백질과도 DNA에 대해 적용 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

현재 세포 생물학 연구를위한 패시베이션 표면의 바다에서 접착 단백질 섬의 순서 배열을 만드는 상당한 관심이있다. 지난 몇 년 동안, 그것은 살아있는 세포가 그들에게 제시 분자의 생화학 적 특성뿐만 아니라 이러한 분자가 제시하는 방식뿐만 아니라, 응답하는 것이 점점 명백 해졌다. 많은 생물학 실험실에서 이제 표준 그러므로 단백질 마이크로 패턴입니다 생성하는 단계; 나노 패턴은 더 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 세포 - 세포 상호 작용의 맥락에서, 패턴에 필요뿐만 아니라 단백질뿐만 아니라 지질 이중층이있다. 이러한 이중 proteo - 지질 패턴은 지금까지 쉽게 접근 할 수 없었다. 우리는 유리에 지원되는 단백질 나노 도트를 만들고 지원되는 지질 이중층 (SLB)로 간 점 공간을 백필하는 방법을 제안 할 수있는 손쉬운 방법을 제공합니다. 트레이서의 사진에서 형광 표백 지질이 포함 SLB, 우리는 이중층의 PL-상당한 나타냄을 입증메탄을 유동성. 형광 그룹과 단백질 점을 기능화하는 이미지 그들과 그들이 정기적 육각형 격자에 정렬 것을 보여주기 위해 우리를 할 수 있습니다. 일반적인 도트 크기가 약 800 ㎚이며 여기 입증 간격은 2 마이크론이다. 이들 기판은 세포 부착, 이동 및 메카 감지 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 것으로 예상된다.

형광 이미지는 도트의 간격과 크기를 측정하기 위하여 분석되었다. 전형적인 간격은였다 1,900 ± 80 nm의 전형적인 도트 크기 600 ± 100 nm의 (도 1g)였다. 간격은 마스크에 사용되는 구슬의 크기에 의해 설정된다. 도트 크기가 비드 크기뿐만 아니라, 증착 조건에 의해 설정된다. SLB는 SLB 촬상 채널에서 볼 구멍 및 NAV 촬상 채널에서 보이는 점 사이의 완벽한 상호 보?...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K 조회수.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다. 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

연구

생체공학

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.