Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.

지난 20년 동안 전 세계적으로 잇따른 병원성 발병은 혈청감시 전략의 중요성을 강조했습니다. 환자의 혈청에서 질병 특이적 항체를 검출하는 역할을 하는 면역분석 플랫폼은 혈청감시의 핵심입니다. 일반적인 예로는 효소 결합 면역흡착 분석법 및 측방 유동 분석이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 황금 표준 방법이지만 병원체 전용 소모품과 특수 장비가 필요하므로 자원이 풍부한 실험실 밖에서는 사용이 제한됩니다.

당사는 최근 CFDB(Cell-Free Dot-Blot)라는 새로운 면역분석 플랫폼을 개발하여 SARS-CoV-2에 대해 인간 및 동물 혈청을 사용하여 검증했습니다. 기존의 면역 분석법과 달리 CFDB 환자 혈청 샘플은 고체상(니트로셀룰로오스 멤브레인)에 고정되는 반면 표적 항원은 분석의 이동상에 부유합니다. 혈청감시 기능에 대한 접근성을 개선하기 위해 CFDB 항원은 체외 단백질 발현을 사용하여 저부하 인프라로 주문형으로 생산됩니다. 여기서 항원은 모든 CFDB 분석을 위해 단일 범용 리포터 단백질을 사용하여 검출할 수 있는 펩타이드 태그와 융합됩니다. 그 결과 CFDB는 다중 웰 플레이트 리더 또는 정제된 상용 분자 분석 구성 요소에 대한 액세스를 요구하지 않습니다. 이러한 설계 고려 사항을 통해 CFDB는 비중앙 집중식 실험실에 대한 접근성, 신종 병원체에 대한 적응성 및 저소득 커뮤니티에 대한 경제성을 제공함으로써 기존 면역분석 플랫폼의 단점을 해결합니다.

현재 기사에서는 CFDB 면역분석을 준비하고 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. SARS-CoV-2 CFDB에 대한 최근 연구를 예로 들어 주문형 무세포 생산을 위한 항원 DNA 설계, CFDB 리포터 단백질 준비, 고체상에서 혈청 샘플의 고정화, 마지막으로 분석의 항원 결합 및 검출 단계를 다룰 것입니다. 우리는 이러한 지침을 따름으로써 연구자들이 CFDB 분석을 조정하여 주어진 병원체에 대한 인간 및 동물 혈청의 면역 반응을 검출할 수 있을 것으로 기대합니다.

COVID-19 팬데믹으로 인해 특히 리소스가 부족한 환경에서 저렴하고 확장 가능한 진단 도구에 대한 필요성이 절실히 드러났습니다¹. 효소결합 면역흡착 분석법(ELISAs)과 같은 기존 면역분석법은 면역 반응을 검출하는 데 필수적인 것으로 입증되었습니다 ^2,3. 그러나 높은 비용, 복잡한 시약에 대한 의존도, 특수 장비에 대한 의존성으로 인해 특히 글로벌 보건 위기 시에는 접근성이 제한됩니다. 이러한 문제에 대응하기 위해 당사는 인간 및 동물 혈청에서 항-SARS-CoV-2 항체를 검출하도록 설계된 저비용의 적응형 면역분석 플랫폼인 CFDB(Cell-Free Dot Blot)를 개발했습니다.

CFDB는 선형 DNA 템플릿 ^4,5를 사용하여 바이러스 항원의 신속한 주문형 생산을 위해 cell-free 합성 생물학을 활용합니다. 이를 통해 기존의 세포 기반 클로닝, 발현 및 정제 공정의 필요성을 없애 항원 생산 속도를 크게 높이는 동시에 비용을 절감할 수 있습니다. CFDB 방법은 혈청이 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직접 발견되는 도트 블롯 형식을 사용하여 항체 검출을 단순화합니다. 이 시스템은 값비싼 멀티웰 플레이트와 특수 실험실 장비의 필요성을 없애주어 배양 및 세척 단계를 위한 간단한 "디핑" 워크플로우를 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 또한 SpyCatcher2-Apex2 peroxidase 키메라가 범용 2차 검출 시약 ^5,6으로 작용하는 SpyCatcher-SpyTag 시스템을 활용합니다. 이는 표준 Escherichia coli 기반 발현을 사용하여 생산되며, 이는 값비싼 상용 항체 접합체에 대한 의존성을 제거합니다. 그 결과, CFDB 시스템은 상용 ELISA 키트의 경우 미화 300달러가 넘는 것에 비해 96개 시료 분석당 약 3달러라는 훨씬 저렴한 비용으로 ELISA와 비슷한 성능으로 혈청학적 분석을 수행할 수 있습니다⁵.

CFDB의 효과를 입증하기 위해 사전 특성화된 인간 및 동물 혈청에서 항체를 검출하는 능력을 테스트했습니다. 우리의 결과는 COVID-19 양성 및 음성 샘플을 식별하는 데 있어 ELISA와 밀접한 상관관계가 있었습니다. 인체 진단 외에도 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터와 재조합 뉴클레오캡시드 단백질로 백신을 접종한 햄스터의 혈청을 테스트하여 동물 모델에서 CFDB의 유용성을 평가했습니다. 이 테스트를 통해 CFDB가 인간 및 수의학 진단에 모두 사용할 수 있는 잠재력을 확인했으며, 이는 CFDB가 종 간의 면역 반응을 모니터링하기 위한 다목적 도구가 되었습니다. CFDB의 주요 장점 중 하나는 유연성입니다. 관심 항원을 인코딩하는 DNA 템플릿을 수정하기만 하면 플랫폼을 빠르게 조정하여 다양한 병원체에 대한 항체를 검출할 수 있으므로 향후 팬데믹 대비에 유용합니다. 저렴한 비용, 간단한 워크플로우 및 최소한의 인프라 요구 사항으로 인해 상용 진단에 대한 접근이 제한된 분산된 실험실 및 리소스가 적은 환경에 특히 적합합니다.

이 작업에서는 CFDB 분석을 준비하고 수행하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 먼저, 분석의 주요 검출 시약인 항원의 무세포 생산을 위한 선형 DNA 템플릿의 설계 및 합성을 다룹니다. 그런 다음 분석의 2차 검출 시약인 SpyCatcher2-Apex2의 준비 단계를 설명합니다. 그 후, 무세포 생산 및 항원 자체의 품질 검사에 대한 지침을 제공합니다. 마지막으로, 인간 또는 동물 혈청 샘플에 대한 CFDB 분석을 수행하는 프로세스를 자세히 설명합니다.

모든 햄스터 실험은 캐나다 공중 보건국의 국립 미생물학 연구소(NML)에서 수행되었으며, 캐나다 인간 및 동물 건강 과학 센터의 승인을 받았으며 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 혈청/혈장 샘플은 사내 테스트를 위해 상업적으로 획득하거나 NML에서 독립적인 테스트를 위해 임상 협력자가 NML에 제공했습니다.

1. 항원 선형 발현 템플릿(LET)의 설계 및 준비

1. Norouzi et ^al.7 의 지침에 따라 N/C 말단 SpyTag를 포함하는 Norouzi et ^al.5에 대한 cell-free 발현 LET를 설계합니다.
   참고: 여기에서는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP, 아미노산 2-419)의 준비에 대한 세부 정보를 제공합니다.
   1. SARS-CoV-2 NP(그림 1 및 보충 파일 1)에 대한 LET에 T7 프로모터 전과 정지 코돈 후에 50 염기쌍 완충액 서열이 있는 5' 및 3' Ter 부위가 포함되어 있는지 확인합니다.
   2. N-말단의 NP 단백질을 His 6-SpyTag-TEV로 태그합니다.
   3. UniProt 데이터베이스(등록 코드 P0DTC9)에서 단백질 염기서열을 얻고 IDT 코돈 최적화 도구⁸을 사용하여 E. coli 기반 발현에 대해 코돈 최적화합니다. 상업적 합성을 위해 10ng/μL의 물에 재현탁된 단일 가닥 DNA 단편으로 이 염기서열을 주문하십시오.
      참고: TEV 프로테아제 절단 부위와 His₆ 태그는 LET 설계의 필수 기능이 아닙니다.
2. PCR은 범용 Ter FW(GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC)로 DNA 단편을 증폭합니다.
   ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) 및 Ter RV(CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
   CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) 프라이머를 사용하여 high-fidelity DNA polymerase kit를 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조).
   1. 100 μL 반응을 다음과 같이 설정합니다: 뉴클레아제가 없는 물 75 μL, 5x DNA 중합효소 완충액 20 μL, 10 mM dNTP 2 μL(최종 농도 200 μM), 100 μM Ter-FW 프라이머 0.5 μL, 100 μM Ter-RV 프라이머 0.5 μL, 10 ng/μL 단일 가닥 LET 1 μL, DNA 중합효소 1 μL(2U).
   2. 다음 PCR 설정을 사용하십시오 : 98 ° C에서 30 초 동안 초기 변성; 35 사이클: 98°C에서 6초, 60°C에서 15초, 72°C에서 90초; 4 °C에서 유지하십시오.
3. 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고, 1% 아가로스 겔에서 샘플을 실행하여 품질을 확인하고, UV-Vis 분광 광도계에서 농도를 측정합니다.
   참고: 미처리 PCR 산물은 cell-free 발현에 직접 사용할 수도 있습니다. 그러나 정제를 통해 보다 표준화된 절차를 수행할 수 있습니다.

그림 1: SARS-CoV-2-NP에 대한 선형 발현 템플릿. His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP 선형 DNA 템플릿의 특징을 나타내는 회로도. 주요 DNA 템플릿 요소에 라벨이 부착되어 있습니다. 관심 단백질(여기서는 NP)에 대한 암호화 서열은 효율적인 발현을 위해 T7 promoter의 transcriptional control 하에 배치됩니다. N-말단에서 NP 단백질에는 SpyCatcher2-Apex2 검출 시약을 사용하여 특이적 검출을 위한 SpyTag가 추가됩니다. x6His-tag 및 TEV 프로테아제 사이트는 일반 LET 설계의 일부로 포함되지만 CFDB 목적에는 필수적입니다. 선형 DNA 주형의 말단에서, 각각 50개의 염기쌍 완충액 서열이 선행하는 "업스트림(upstream)" 및 "다운스트림(downstream)" Ter 부위가 cell-free lysate에서 exonucleolytic DNA degradation에 대한 Tus 매개 보호를 위해 포함됩니다. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질; LET = 선형 표현식 템플릿; TEV = 담배 에칭 바이러스; CFDB = cell-free 점 블롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질의 정제

1. 원래 Norouzi et ^al.5 에서 생성된 pET24b-SpyCatcher2-Apex2 플라스미드( 보충 파일 2 의 전체 염기서열 및 보충 그림 S1의 플라스미드 맵)를 사용하여 SpyCatcher2-Apex-2 리포터 단백질을 준비합니다.
2. 50μg/mL 카나마이신을 함유한 한천 플레이트와 용원 육수(LB)를 준비합니다. PET24b-SpyCatcher2-Apex2 플라스미드로 E. coli BL21 (DE3) 세포를 형질전환시킵니다. 단일 콜로니를 15mL 스타터 LB 배양액에 접종하고 250RPM으로 진탕하면서 37°C에서 하룻밤 동안 성장합니다.
3. 다음날, 50μg/mL 카나마이신이 함유된 500mL의 새로운 LB 배지에 스타터 배양 10mL를 추가합니다. 배양액이 600 nm에서 0.6-0.8 (~ 3 h)의 광학 밀도에 도달 할 때까지 250 RPM에서 진탕하면서 37 ° C에서 배양합니다.
4. 0.5 mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 및 1 mM 5-아미노레불린산 염산염으로 배양물을 보충하여 SpyCatcher2-Apex2의 발현을 유도합니다. 성장 온도를 30°C로 낮추고 배양물을 4시간 더 배양합니다.
5. 8,000 ×g에서 15 분 동안 원 심분리하여 박테리아를 수확합니다. 세포 용해를 진행하거나 사용할 때까지 펠릿을 -80°C에서 보관합니다.
6. 50mM Tris-HCl(pH 7.8), 300mM NaCl, 1mg/mL 라이소자임, EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 및 1mM 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 20mL의 용해 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 50 초 ON 및 10 초 OFF 간격으로 50 % 진폭으로 초음파 처리하여 세포를 3 분의 총 ON 시간으로 용해시킵니다.
7. 4 °C에서 1 시간 동안 20,000 × g 에서 원심 분리로 용해물을 정화하십시오. 0.2μm 주사기 필터를 통해 상층액을 통과시킵니다.
8. 정화된 용해물에 250μM의 최종 농도로 염화헤민을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 단백질 정제를 진행합니다.
   참고: 염화헤민을 사용한 배양은 최적의 효소 활성을 위해 Apex-2 과산화효소로의 헴 통합을 최대화합니다.
9. 정화된 용해물에 Ni 수지 2.5mL를 첨가하고 4°C에서 45분 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 혼합물을 중력 흐름 컬럼에 적용하고 50mL의 Tris 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.8), 300mM NaCl 및 1mM DTT)로 수지를 세척합니다.
10. SpyCatcher2-Apex2 단백질을 400mM 이미다졸이 함유된 25mL의 Tris 완충액에 용리시킵니다. 농축액과 완충액은 0.5-1.0mL의 최종 부피를 목표로 원심 필터 장치를 사용하여 용출액을 Tris 완충액으로 교환합니다.
11. SpyCatcher2-Apex2(27,390 ^{M-1 cm-1})의 몰 흡광 계수를 사용하여 UV-Vis 분광 광도계에서 단백질 농도를 측정합니다. 글리세롤을 최종 농도 40%에 추가하고 부분 표본을 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 이 프로토콜은 약 40mg의 고순도 및 활성 SpyCatcher2-Apex2를 생성할 것으로 예상되며, 이는 표준 96개 샘플 블롯 크기에서 400 CFDB 실행에 충분합니다.
12. 기존 웨스턴 블롯⁹ 를 사용하여 SpyTagged 단백질을 검출하고 CFDB 실험을 위해 항상 0.05% Tween-20(TBST)을 함유한 1x Tris-buffered saline의 5% 무지방 분유의 멤브레인을 차단합니다. 차단 용액에서 최종 농도 10μg/mL의 SpyCatcher2-Apex2 단백질을 사용합니다.
    참고: SpyCatcher2-Apex2 리포터는 신호 개발을 위해 향상된 화학발광(ECL) 솔루션이 필요합니다. ECL 용액은 상업적으로 얻거나 Mruk et ^al.10의 지침에 따라 사내에서 준비할 수 있습니다. 여기서 최종 ECL 용액은 100mM Tris-HCl(pH 8.6)에서 0.4mM p-쿠마르산, 2.5mM 루미놀 및 0.015% H_2O2로 구성됩니다.

3. Cell-free 생산 및 항원의 품질 검사

1. Levine et ^al.11 및 Norouzi et ^al.5의 지침에 따라 E. coli BL21 cell-free 발현 용해물 및 반응 성분을 준비하고 조립합니다. 대표적인 100 μL 반응을 위해 다음과 같이 최종 반응 혼합물에 5 μM Tus 단백질과 1.2 μM T7 RNA 중합효소를 보충합니다: 용액 A 14.6 μL, 용액 B 14 μL, E. coli BL21 용해물 33.3 μL, 200 mM Tus 단백질 2.5 μL, 100 mM T7 RNA 중합효소 1.2 μL, 1μL의 1.5μM 선형 DNA 템플릿, 33.4μL의 뉴클레아제가 없는 물.
   참고: E. coli BL21 cell-free lysate 준비에 대한 주요 지침은 Supplemental File 3을 참조하고, 용액 A 및 B의 자세한 레시피는 Supplemental Table S1을 참조하십시오. E. coli cell-free 발현 시스템은 반응에 Tus 및 T7 RNA 중합효소가 보충되는 한 대체 프로토콜을 사용하여 준비하거나 상업적으로 얻을 수도 있습니다.
2. PCR 튜브의 cell-free 반응에 10%(v/v) crude PCR 산물을 첨가하여 초기 5μL 규모의 발현 테스트를 수행합니다. 30°C에서 15시간 동안 흔들지 않고 배양합니다.
3. 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel(SDS-PAGE)에 cell-free 반응 1μL를 로딩한 후 2.12단계에서 설명한 대로 웨스턴 블롯용 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달하여 NP 항원의 발현 품질을 확인합니다. SpyTag를 통한 블롯 라벨링에 SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질을 사용하고, 선택적으로 표적 항원에 대한 특정 상용 항체(여기서는 anti-SARS-CoV-2-NP)를 사용합니다.
4. CFDB 분석에 사용할 15 nM 정제 LET 산물로 1 mL 규모의 무세포 반응을 조립합니다. 발현 혼합물을 15mL 원뿔형 튜브에서 30°C에서 15시간 동안 80RPM으로 진탕하여 배양합니다. 웨스턴 블롯을 사용하여 발현 품질을 확인하고 -20 °C에서 50 μL 분취량을 보관합니다.

4. 혈청 샘플

1. 기관 인간 연구 윤리 위원회 또는 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 표준 절차를 사용하여 상업적 출처 또는 임상 협력자 또는 사내에서 인간/동물 혈청(또는 혈장) 샘플을 얻습니다. 오염 위험을 완화하기 위해 적절한 시료 전처리 조치를 취했는지 확인합니다.
   참고: 전처리 조치에는 용제 세제 처리, 열 불활화 및 혈액 매개 바이러스 마커 테스트가 포함될 수 있습니다. 전혈에서 혈청 및 혈장을 분리하는 데 유용한 프로토콜이 있다¹². 다른 면역분석 플랫폼과 마찬가지로 초기 감염 또는 질병 발병 후 조기(<3주)에 채취한 혈청 샘플은 적절한 수준의 항체 반응을 포함하지 않을 것으로 예상되므로 결과를 주의해서 다루어야 합니다.
2. SARS-CoV-2 NP CFDB 시약의 품질 검증을 위해 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control) 세계보건기구(WHO)의 항-SARS-CoV-2 면역글로불린에 대한 국제 참조 패널을 사용하십시오(여기에는 다양한 수준의 항-NP 면역글로불린¹³ x1 pre-COVID-19 및 x4 SARS-CoV-2 양성 샘플이 포함되어 있습니다). 또는 다른 출처에서 미리 특성화된 건강하고 긍정적인 혈청 샘플을 사용하십시오.
3. CFDB 실험의 경우, 정확도를 높이고 분석 및 결과 해석을 용이하게 하기 위해 여러(>3)의 건강한 혈청 샘플을 풀링하여 음성 대조군 샘플을 얻거나 준비합니다.

5. CFDB(Cell-free Dot Blot) 절차

1. 마스터 그리드 이미지 파일(보충 그림 S2)을 다운로드하여 인쇄합니다. 마스터 그리드는 각각 직경 2mm의 12 x 12개의 원을 포함하는 6 x 6cm 패턴이며 96웰 플레이트와 유사한 스포팅 용량을 제공합니다.
2. 두 층의 접착 PCR 플레이트 밀봉 필름 사이에 그리드를 단단히 끼우고 외부 그리드 경계를 따라 크기에 맞게 자릅니다. 2mm 바이옵시 펀치를 사용하여 표시된 각 원의 속을 비웁니다.
   참고: 이 마스터 그리드는 70% 에탄올로 닦은 후 여러 번 재사용할 수 있습니다.
3. 6.5 x 6.5cm 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 절단하여 깨끗한 표면의 마스터 그리드 아래에 놓고 그림 2 및 보충 그림 S3과 같이 접착 테이프를 사용하여 설정을 고정합니다. 마커 펜을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인의 가장 바깥쪽 원 위치를 표시하여 샘플 스포팅 후 멤브레인을 절단하기 위한 가이드로 사용합니다.
4. 혈청 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(pH 7.4)에 1/10 희석합니다. 마이크로피펫을 사용하여 각 시료의 0.4μL 부피를 미리 결정된 그리드 위치에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 3회 분주합니다. 분배하는 데 지점당 약 15초가 걸립니다.
   참고: 결과 분석에 필요하므로 각 분석에 negative control 및 positive control 샘플을 모두 포함해야 합니다.
5. 점박이 샘플이 결합되고 건조될 때까지 주변 온도에서 10분 동안 기다립니다. 핀셋을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막을 조심스럽게 회수하고 표시된 바깥 쪽 원을 따라 자릅니다.
6. 10cm 페트리 접시에 10cm 페트리 접시에 10mL의 차단 용액(TBST의 5% 무지방 분유)으로 멤브레인을 실온에서 30분 동안 차단하고 100RPM으로 부드럽게 흔듭니다.
7. cell-free 항원 발현 혼합물의 50μL 분취액을 10cm 페트리 접시에 5mL의 차단 용액에 해동하고 첨가합니다. 멤브레인을 이 항원 함유 용액에 직접 옮기고 100RPM으로 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 이것은 SpyTagged 항원이 항체를 포함하는 스폿 위치(존재하는 경우)에 결합하는 기본 검출 단계입니다.
8. 멤브레인을 헹구고 5분 동안 세척한 후 2차 검출 단계로 진행하기 전에 TBST에서 다시 헹굽니다.
9. 100RPM으로 진탕하면서 1시간 동안 정제된 SpyCatcher2-Apex2 단백질이 10μg/mL 함유된 10mL의 차단 버퍼에 멤브레인을 배양합니다.
10. 멤브레인을 헹구고 TBST에서 2 x 5 분 세척하고 TBS에서 최종 헹굽니다.
11. 블롯 이미징 기기에 가까운 깨끗한 작업 영역에 파라필름 조각을 붙이고 고정합니다. 핀셋을 사용하여 멤브레인을 두드려 과도한 액체를 제거하고 파라필름 위에 멤브레인을 놓습니다.
12. 즉시 멤브레인 위에 3mL(100μL/^cm2)의 ECL 용액을 추가하고 실온에서 정확히 90초 동안 배양합니다.
13. 즉시 멤브레인을 탭드라이어하고 결과를 시각화하기 위해 화학발광 호환 이미징 기기로 옮깁니다.
    참고: 최적의 이미징 시간은 기기마다 다를 수 있습니다. 기기의 기본 자동 획득 시간 설정을 사용하는 것이 좋으며, 없는 경우 사전 특성화된 혈청 샘플을 사용하여 이미지 획득 시간을 최적화하는 것이 좋습니다.
14. 기기의 이미지 분석 기능을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인의 3개의 빈(배경) 위치를 포함한 스폿 강도를 얻을 수 있습니다. 스폿당 일정한 측정량을 유지하십시오. 데이터를 스프레드시트로 내보내고, 각 스폿 위치에 올바르게 레이블을 지정하는 것을 기억합니다.
15. 삼중 스폿 강도의 평균 및 표준 편차(SD)를 계산합니다. 그런 다음 모든 샘플에서 니트로셀룰로오스 멤브레인 배경을 뺍니다.
16. 다음 방정식을 사용하여 -/+ 결과의 해석을 위한 컷오프 값을 구합니다.
    (네거티브 대조군의 평균) + (네거티브 대조군의 3 x SD). 샘플의 평균 강도가 컷오프 값보다 높으면 양수, 평균 강도가 컷오프 값 아래로 떨어지면 음수로 간주합니다.
    참고: CFDB 절차의 개략도는 그림 3에 나와 있습니다.

그림 2: CFDB 어셈블리. CFDB 마스터 그리드 및 NC 멤브레인 어셈블리 설정의 회로도입니다. 마스터 그리드는 NC 멤브레인에 오버레이되어 혈청 샘플의 스포팅 및 고정을 위한 규칙적이고 주소 지정 가능한 패턴을 제공합니다. 약어: CFDB = cell-free dot blot; NC = 니트로셀룰로오스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: CFDB 워크플로우의 개략도 . CFDB 분석에서는 소량(<0.4 μL)의 10x 희석 혈청 샘플을 주소 지정 가능한 개별 위치(중간 패널)의 미리 절단된 니트로셀룰로오스 멤브레인(왼쪽 패널)에 수동으로 분주합니다. 3중 반점에 반점당 하나의 혈청 샘플을 증착하고 혈청의 총 항체 저장소를 포함한 단백질 함량을 고체 NC 기질(중간 패널의 베이지색 반점)에 고정시킵니다. 이 예시에서, 혈청 샘플에 포함된 항-NP 항체는 먼저 CFDB 1차 검출 시약 SpyTag-NP에 의해 결합될 수 있으며, 최종적으로 CFDB 2차 검출 시약 SpyCatcher2-Apex2(오른쪽 패널 확대 버블)에 의해 검출될 수 있습니다. 이 그림은 Norouzi et ^al.5에서 발췌한 것입니다. 약어: CFDB = cell-free dot blot; NP = 뉴클레오캡시드 단백질; LET = 선형 표현식 템플릿. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표적 항원에 대한 선형 발현 템플릿의 PCR 증폭
SARS-CoV-2 NP LET를 PCR 증폭하기 위해 프로토콜 섹션 1.2에 설명된 대로 범용 Ter 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하고 PCR 산물의 정제를 진행하기 전에 아가로스 겔(그림 4)에서 제품의 1μL를 확인했습니다.

그림 4: 선형 발현 템플릿의 PCR. Lane 1: 1 kb DNA Ladder 및 Lane 2: His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP(1,630 bp)에 대한 PCR 증폭 선형 DNA 템플릿에서 보여주는 1% 아가로스 겔. 약어: PCR = 중합효소 연쇄 반응; NP = 뉴클레오캡시드 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질의 정제
SpyCatcher2-Apex2 단백질은 프로토콜 섹션 2에 기재된 바와 같이 제조되었습니다. Apex2 과산화효소에 적절한 헴 통합을 보장하기 위해 단백질 합성 중 및 세포 용해 후에 각각 5-aminolevulinic acid hydrochloride(헴 전구체) 및 염화헤민을 첨가했습니다. 최종 제품의 품질을 보장하기 위해 모든 정제 단계의 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로드했습니다(그림 5).

그림 5: SpyCatcher2-Apex2 정제. SpyCatcher2-Apex2 단백질의 정제 단계에서 얻은 분획을 보여주는 12% SDS-PAGE 겔. L: 용해물(2 μL), FT: 플로우스루(2 μL), W: 세척(10 μL), E1-3: 각각 용출 1-3(10 μL). 42kDa에서 예상 대역이 표시됩니다. 약기 : SDS-PAGE = 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

cell-free 발현 및 표적 항원의 품질 검증
SDS-PAGE를 사용하여 NP 단백질의 5μL 규모의 파일럿 발현 및 품질 검사를 수행한 후, 프로토콜 섹션 3에 설명된 대로 1mL 규모의 발현을 수행했습니다. 최종 cell-free 발현 혼합물의 1μL 샘플에 SpyCatcher2-Apex2 및 anti-NP 상용 항체에 의한 검출을 위해 별도로 웨스턴 블롯을 적용했습니다(그림 6). 이 단계는 항원이 성공적으로 발현되고 항-NP 면역글로불린과 SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질 모두에 특이적으로 결합할 수 있는지 확인합니다.

그림 6: cell-free 생성 항원의 품질 검사. SpyCatcher2-Apex2(왼쪽 패널)와 anti-NP rabbit polyclonal antibody(오른쪽 패널)를 사용하여 cell-free 생성된 NP 단백질의 웨스턴 블롯 검출. 50kDa에서 예상되는 전체 길이 제품이 표시되어 있습니다. 두 겔의 크기 마커는 Color Pre-stained Protein Standard, Broad Range입니다. 이 그림은 Norouzi et ^al.5에서 발췌한 것입니다. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

사전 특성화된 인간 혈청을 사용한 CFDB 시약 검증
CFDB 시약의 품질이 우수하고 CFDB 프로토콜이 성공적으로 구현되었는지 확인하기 위해 NISBC-WHO 국제 참조 패널(NISBC)에서 제공하는 항-SARS-CoV-2 면역글로불린 20/268¹³에 대한 사전 특성화된 혈청 패널을 사용했습니다. 이 패널은 다양한 수준의 항체 반응을 가진 x1 pre-COVID-19(음성) 및 x4 SARS-CoV-2 양성 샘플로 구성됩니다(보충 표 S2). 또한 RayBiotech(CoV-PosSet)로부터 COVID-19 이전 샘플(음성) 샘플 10개와 SARS-CoV-2 양성으로 추정되는 샘플 20개가 포함된 혈청 패널을 획득했습니다. 우리는 실험실에서 수행된 모든 실험에서 음성 대조군으로 사용하기 위해 10개의 모든 음성 혈청에서 동일한 분획을 풀링했습니다. 이 풀링 전략은 단일 음성 샘플이 결과 해석을 복잡하게 만들 수 있는 미묘한 수준의 배경 신호를 나타낼 수 있으므로 결과의 정확성과 견고성을 높입니다.

프로토콜 섹션 5에 따라 사전 특성화된 WHO 참조 패널과 RayBiotech의 CoV-PosSet에서 CFDB 분석을 수행하고 블롯을 이미지화했습니다. Image Lab Software의 볼륨 도구를 사용하여 각 스폿 위치에 균일한 원을 그리고 개별 신호 강도를 내보냈습니다. 모든 샘플에서 NC 멤브레인 배경 강도를 뺀 후 컷오프 값((네거티브 대조군의 평균) + (3 x 네거티브 대조군의 SD))도 평균 신호 강도에서 뺍니다. 샘플은 신호 강도가 차단 값보다 높을 경우 anti-NP 양성으로 간주됩니다. 블롯의 이미지와 해당 신호 강도 차트는 그림 7에 나와 있습니다. 그 결과, CFDB 기법은 cell-free produced SARS-CoV-2 NP 단백질을 사용하여 RayBiotech 세트에서 2개의 샘플(RB P5 수집 증상 발현 후 34일(dpso) 및 RB P10 수집 4dpso)을 제외한 모든 음성 샘플과 모든 양성 샘플을 정확하게 식별할 수 있음을 보여줍니다. 공급업체의 데이터시트에 대한 추가 검사에서 이 두 샘플은 모두 ELISA에 의한 anti-S1RBD(Spike Receptor Binding Domain) IgG 및 측면 유동 분석에 의한 anti-N IgG/M에 대해서도 음성으로 나타나는 것으로 확인되었으며(보충 표 S3), 이는 이러한 샘플에서 검출 가능한 항체 수준이 부족함을 시사합니다.

그림 7: 사전 특성화된 상용 human sera를 사용한 CFDB 검증. (A) WHO 국제 참조 패널 및 RayBiotech PosSet 혈청 샘플의 anti-SARS-CoV-2 NP CFDB를 나타내는 블롯 이미지. 샘플은 열 단위로 3회씩 발견되었으며 레이블로 식별되었습니다. (B) 패널 A의 블롯에 대한 정량화된 화학발광 신호 강도 값을 나타내는 그래프. 네거티브 컨트롤은 컷오프 값을 설정하는 데 사용되었으며 모든 측정은 표준 편차(SD)± 삼중 스폿의 수단입니다. 이 그림은 Norouzi et al.에서 발췌했습니다.⁵. 약어: Neg Cont = RayBiotech의 10개의 preCOVID-19 샘플을 모두 풀링하여 얻은 음성 대조군 샘플; RB N1 내지 N10 = RayBiotech 추정 음성 시료 1 내지 10; RB P1 내지 P20 = RayBiotech는 양성 샘플 1 내지 20을 추정했다. CFDB = cell-free 점 블롯; NP = 뉴클레오캡시드 단백질; WHO = 세계보건기구(WHO). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간 환자 혈청을 사용한 CFDB 분석의 독립적 테스트
CFDB 분석의 적용 가능성을 입증하기 위해 CFDB 재료와 지침을 다른 위치(위니펙 국립 미생물학 연구소(NML))에 있는 독립적인 협력 실험실에 제공했습니다. 목표는 NML의 현장 연구 그룹이 클리닉에서 수집한 인간 환자 샘플을 사용하여 플랫폼을 독립적으로 테스트하는 것이었습니다. 총 24개의 샘플(NP 항체에 대해 ELISA에 의해 확인된 x12 음성 및 x12 양성 확인(보충표 S4))을 CFDB에 적용하고 결과를 상기한 바와 같이 분석했습니다. 그림 8에서 볼 수 있듯이 CFDB는 모든 x12 음성 및 x12 양성 샘플을 올바르게 식별하여 독립적인 테스트에서 분석의 견고성과 실용성을 확인했습니다.

그림 8: NML에서 인간 환자 혈청을 사용한 CFDB의 독립적 테스트. (A) 12명의 COVID-19 음성(N1 - N12) 또는 12명의 양성(P1 - P12) 환자 샘플에서 항-SARS-CoV-2 NP CFDB를 나타내는 블롯 이미지. 혈청은 라벨에 표시된 대로 열 방향으로 세 번 발견되었습니다. (B) 패널 A의 블롯에서 정량화된 화학발광 신호 강도 값 . 모든 측정은 표준 편차(SD)± 삼중 스폿의 수단입니다. 이 그림은 Norouzi et al.에서 발췌했습니다.⁵. 약어: CFDB = cell-free 점 얼룩; NML = 국립 미생물학 연구소; NP = 뉴클레오캡시드 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SARS-CoV-2에 감염된 햄스터 혈청을 사용한 CFDB 분석의 독립적 테스트
NML 팀은 동일한 CFDB 시약과 지침을 사용하여 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터 혈청에 대해 CFDB 분석을 수행하여 이 분석이 동물 샘플에서 항체 반응을 감지하는 데에도 사용될 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 총 36개의 샘플, x12 감염 전 혈청과 24개의 감염 후 혈청을 검사했습니다. 추정 양성 혈청은 감염 후 140일(dpi 140, n = 3)에 검체를 채취한 SARS-CoV-2의 10⁵ 50% 조직 배양 감염 용량(TCID₅₀)에 감염된 동물에서 나온 혈청이었습니다. 또는 DPI 140에서 재감염되고 5일 후에 샘플링되었습니다(DPI 5, N = 21). 그림 9에서 볼 수 있듯이, 모든 감염 전 혈청은 신호 강도가 컷오프 값보다 낮았으며, 감염 후 24개 혈청 중 18개(모두 재감염 후 5일 이후부터)에서 별개의 양성 신호 강도를 이끌어냈습니다. 흥미롭게도, CFDB가 놓친 것으로 추정되는 6개의 샘플 중 3개의 샘플(모두 초기 dpi 140)은 표준 anti-NP ELISA(보충 표 S5)를 사용하여 검출할 수 없었으며, 이는 시간이 지남에 따라 항체 수준의 손실 또는 감소를 나타냅니다.

그림 9: NML에서 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터 혈청을 사용한 CFDB의 독립적 테스트. (A) SARS-CoV-2의 10⁵ TCID₅₀ 을 사용하여 햄스터 혈청 감염 전(dpi 0, n = 12), 감염 후 140일(dpi 140, n = 3) 및 재감염 후 5일(dpi 5, n = 21)에 항-SARS-CoV-2 NP CFDB를 제시하는 블롯 이미지. 각 샘플은 열 방향으로 삼중 반점으로 증착되고 원래 NML 연구의 계획에 따라 라벨링되었습니다. (B) 패널 A의 블롯에서 정량화된 화학발광 신호 강도 값 . 모든 측정은 표준 편차(SD)± 삼중 스폿 수단입니다. 이 그림은 Norouzi et al.에서 발췌했습니다.⁵. 약어: CFDB = cell-free 점 얼룩; NML = 국립 미생물학 연구소; NP = 뉴클레오캡시드 단백질; DPI = 감염 후 일수; TCID₅₀ = 50% 조직 배양 감염량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP 선형 발현 주형에 대한 뉴클레오티드 서열. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: pET24b SpyCatcher2-Apex2 플라스미드의 전체 뉴클레오티드 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: E. coli BL21 cell-free protein expression lysate를 준비하는 주요 단계에 대한 개요 입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: pET24b SpyCatcher2-Apex2 플라스미드에 대한 맵을 구성합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: CFDB 마스터 그리드의 인쇄 가능한 사본. 약어: CFDB = cell-free dot blot. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3: CFDB NC 멤브레인 및 마스터 그리드 어셈블리 설정 이미지. NC 멤브레인은 하단의 유리판과 상단의 마스터 그리드 패턴 사이에 끼워져 고정 테이프를 사용하여 어셈블리를 고정합니다. 이 그림은 Norouzi et al.에서 발췌했습니다.⁵. 약어: CFDB = cell-free 점 얼룩; NC = 니트로셀룰로오스 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 무세포 반응 혼합물의 용액 A 및 용액 B 성분에 대한 전체 레시피. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: NIBSC WHO Reference Panel 20/268에 대한 샘플 정보( 그림 7 참조). 약어: NISBC = 국립 생물학 표준 및 통제 연구소; WHO = 세계보건기구(WHO). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S3: 샘플 정보 RayBiotech CoV-PosSet( 그림 7 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S4: 인간 환자 혈청 샘플에 대한 NP ELISA 결과(NML에서 수행). 그림 8도 참조하십시오. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질; ELISA = 효소 결합 면역흡착 분석법; NML = 국립 미생물학 연구소. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S5: SARS-CoV-2 감염된 햄스터 혈청에 대한 NP ELISA 결과(NML에서 수행). 그림 9도 참조하십시오. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질; ELISA = 효소 결합 면역흡착 분석법; NML = 국립 미생물학 연구소. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

COVID-19는 감염 발생을 통제하고 글로벌 보건 전략을 최적화하기 위해 접근 가능하고 강력한 진단의 중요성을 강조했습니다. 보호 항체를 검출하는 혈청학적 검사는 새로운 변이의 전염 패턴을 추적하고, 핫스팟을 식별하고, 백신 개발을 안내하고, 의심 사례를 분류하고, 취약 인구를 보호하는 데 필수적인 것으로 입증되었다¹⁴. 팬데믹은 또한 접근성 테스트의 불평등을 드러냈으며, 이는 밀린 업무와 정교한 장비를 갖춘 시설에 대한 요구 사항으로 인해 분노했습니다¹⁵. 따라서 이제 초점은 미래의 발병에 대한 글로벌 대응을 강화하는 데 맞춰져 있으며, 이를 위해서는 테스트 장벽을 낮추고 예측할 수 없는 위협에 신속하게 적응할 수 있는 새로운 혁신이 필요합니다.

CFDB는 종이 기반 면역분석법으로, 고체상에서 환자 검체를 고정화하고 항바이러스 항체 검출을 위한 이동상 무세포 생성 항원을 전달하여 ELISA 또는 측방 유동 분석법으로 일반적으로 수행되는 혈청학적 검사를 단순화합니다⁵. 이 분석은 웨스턴 블롯 기능이 있는 기본 실험실 환경에서 수행할 수 있습니다. 한편, CFDB용 시약은 기본 연구 환경에서 국부적으로 생산할 수 있으며 새로운 병원체에 대한 분석을 용도 변경하기 위해 쉽게 교체할 수 있습니다. 키메라 SpyCatcher2-Apex2 범용 검출 시약은 상용 2차 항체 콘주게이트를 소싱할 필요가 없으며 E. coli 발현 시스템에서 효율적으로 생산됩니다. CFDB는 또한 상용 96웰 ELISA의 경우 약 300달러에 비해 분석 키트당 약 3달러에 불과하여 적은 비용으로 임상 분석을 병렬로 수행할 수 있는 고처리량 기능을 제공합니다.

COVID-19 혈청학적 검사를 위한 CFDB 구성은 cell-free transcription-translation system이 표적 항원인 SARS-CoV-2 NP를 생성하도록 지시하는 선형 DNA 템플릿을 설계하여 달성되었습니다. 그런 다음 인간과 동물의 혈청을 니트로셀룰로오스 멤브레인 그리드에 발견하고 무세포 항원 발현 혼합물에 이어 SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질로 배양을 수행했습니다. 이 연구에서 CFDB는 당사 실험실과 독립 환경(NML) 모두에서 COVID-19 음성 및 양성 피험자의 혈청에 대해 수행되었으며, 전반적으로 양성 샘플과 음성 샘플을 구별하기 위해 ELISA와 좋은 상관 관계가 달성되었습니다. 풀링된 건강한 혈청을 CFDB 음성 대조군으로 사용하고 이 샘플을 기반으로 분석 컷오프 값을 계산함으로써 위음성/양성 식별의 위험을 최소화했습니다.

CFDB 분석의 높은 민감도는 광범위하게 사전 특성화된 NIBSC의 WHO Reference Panel 20/268¹³에서 모든 샘플, 특히 항체 역가가 가장 낮은 샘플(샘플 20/140 낮음, 보충 표 S2 및 그림 7 참조)을 명확하게 구별할 수 있는 능력으로 나타납니다. 마찬가지로, CFDB의 높은 특이성은 이 연구에서 테스트된 35개의 건강한 혈청 중 어느 것에도 위양성 식별이 없다는 점에서 입증됩니다. 중요한 것은 다중 사이트 임상 검증을 통해 CFDB 프로토콜이 널리 사용되기에 충분히 간단하며 다른 사용자가 실행할 때 표준 ELISA에 필적하는 고성능을 유지한다는 것입니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 그리고 다른 사람들에 의해 밝혀진 바와 같이,¹⁶, 대장균 용해물에서 생산된 무세포 항원은 -20 °C에서 최소 3개월 동안 안정적이며, 여러 무세포 항원 배치 제제는 서로 구별할 수 없을 정도로 수행됩니다.

CFDB 플랫폼을 널리 채택하고 시스템 설계를 새로운 병원체로 전환하기 전에 몇 가지 고려 사항을 고려해야 합니다. CFDB 플랫폼은 바이러스 항원 또는 항원 단편이 무세포 발현 시스템에 의해 적절하게 합성되어 항원 부분이 존재하고 항체 결합에 사용할 수 있도록 요구합니다. 예를 들어, 처음에는 SARS-CoV-2 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)도 CFDB 분석에 포함하려고 했습니다. 그러나 높은 수율의 발현에도 불구하고 복잡한 이황화 결합에 대한 요구 사항(시스테인 아미노산이 없는 NP 항원과 달리)으로 인해 RBD 생성물은 즉시 응집되고 대장균 추출물에 불용성으로 나타나 신뢰할 수 있는 CFDB 프로브로 사용할 수 없었습니다. 적절한 접힘과 항원 기능을 위해 복잡한 번역 후 변형이 필요한 이러한 시나리오에서는 진핵 기반 cell-free 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 과산화효소 기반 면역분석법과 마찬가지로, 헤모글로빈 과산화효소 활성이 결과를 혼란스럽게 할 가능성이 있기 때문에 눈에 띄는 용혈이 있는 혈청 샘플을 배제하는 것도 필수적입니다. 마지막으로, CFDB는 총 항체 반응을 감지하도록 설계되었으며 항체-항원 상호 작용에 관련된 특정 면역글로불린 클래스에 대해 보고하지 않습니다.

결론적으로, CFDB는 cell-free 합성 생물학 요소와 점 블로팅의 요소를 병합하여 혈청학적 검사를 간소화하는 새로운 진단 기술입니다. CFDB는 기존 ELISA에 대한 비용 효율적인 대안을 제공하며, 팬데믹 기간 동안 종종 발생하는 경우와 같이 추가 테스트 용량이 필요할 때 전 세계 연구 실험실에 쉽게 배포할 수 있습니다. 따라서 CFDB는 차세대 글로벌 팬데믹 대응에서 최전선 도구 역할을 할 수 있으며, 이는 새로운 위협에 신속하게 적응할 수 있고 저소득 및 중간소득 국가의 검사 역량을 강화할 수 있습니다.

M.N.과 K.P.는 cell-free dot blot 방법의 공동 발명자입니다. 본 작품에 관한 가특허출원이 개시되었습니다(PCT/CA2024/050097, 2024년 1월 출원).

S.S.와 R.Z.는 미국 국방고등연구계획국(DARPA)의 자금 지원을 받고 있으며, 계약 번호는 N66001-23-2-4042입니다. 표현된 견해, 의견 및/또는 조사 결과는 저자의 견해이며 국방부 또는 미국 정부의 공식 견해나 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 이 작업은 CIHR 재단 보조금 프로그램(201610FDN-375469), CIHR 캐나다 연구 의장 프로그램(950-231075 및 950-233107), 캐나다 최초 연구 우수성 기금(Canada First Research Excellence Fund)에서 자금을 지원받고 캐나다 국방 연구 개발부의 캐나다 안전 및 보안 프로그램(계약 39903-200137)에서 K.P.에 자금을 지원하는 토론토 대학의 의학 디자인 이니셔티브(Medicine by Design Initiative)에서 K.P.에 대한 자금으로 지원되었습니다. 그림 1 및 보충 그림 S1 은 SnapGene Viewer를 사용하여 생성되었습니다.