マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

本プロトコルは、腫瘍細胞を椎間腔に注入することにより、脊髄神経膠腫の再現可能なマウスモデルの開発について説明し、研究および治療法開発のためのより効果的で低侵襲的なアプローチを提供します。

脊髄グリオーマは一般的に脊髄の悪性腫瘍であり、障害の発生率が高くなります。しかし、脊髄神経膠腫に関する統一された治療ガイドラインと包括的なデータは、適切な前臨床動物モデルがないため、依然として限られています。シンプルで再現性のある動物モデルの開発は、基礎研究やトランスレーショナル研究を進める上で不可欠となっています。マウスの脊髄は人間の脊髄と構造的な類似性を共有しているため、マウスモデルが理想的です。このプロトコルは、第 7 頸椎の棘突起をガイドとして使用して、腫瘍細胞を椎間腔に直接注入することにより、脊髄神経膠腫の再現可能なマウス モデルの生成を説明しています。他の方法と比較して、このアプローチはより効果的で便利であり、切開が小さく、侵襲性と失血が減少し、回復が速く、腫瘍形成がより安定します。このモデルにより、疾患メカニズムの理解が進み、手術戦略の最適化が図られ、脊髄神経膠腫の治療薬の開発が支援されることが期待されます。

馬尾のものを含む脊髄神経膠腫は、一般的に脊髄の悪性新生物であり、20%〜40%が星状細胞腫として分類され、残りは上衣腫として分類されます¹。組織学的特徴に基づいて、脊髄神経膠腫は4つのグレード(I-IV)に分類されます。悪性度IおよびIIの腫瘍は低悪性度神経膠腫と考えられ、悪性度IIIおよびIVの腫瘍は高悪性度神経膠腫に分類されます。脊髄グリオーマは脊髄のどの部分にも発生する可能性がありますが、頸部に最も多く見られ(症例の33%)、他の領域では比較的まれで、胸部に26%、腰部に24%あります²。

脊髄神経膠腫の主な治療選択肢は、手術、放射線療法、およびアルキル化剤であり、主に脳神経膠腫の臨床試験から推定されています³。しかし、これまでの研究では、脊髄神経膠腫の組織学的プロファイルは脳神経膠腫の組織学的プロファイルと似ているが、明確な分子シグネチャーの存在が脳神経膠腫と区別されることが実証されている⁴。私たちのコホートでは、脊髄神経膠腫の患者は、補助化学療法または放射線療法のいずれからも有意な利益を得られず、現在の治療法の有効性が限られていることと、新しい治療戦略の必要性が強調されています⁵。したがって、基礎研究や前臨床研究を進めるためには、信頼性と情報量の多い動物モデルが不可欠です。

現在、Minru et ^al.6 によって記述された方法を含む、いくつかの確立された脊髄神経膠腫モデルが存在します。これらのモデルは、主に胸椎除去技術を利用して脊髄を露出させます^6,7,8。ラットモデルは過去にも採用されてきましたが、マウスモデルと比較して、コストが高く、サンプルサイズが小さく、管理上の課題が大きいという課題があります。さらに、ラットモデルよりも遺伝子改変実験マウスモデルが利用可能です。免疫コンピテントマウスモデルは、脊髄腫瘍微小環境内の免疫応答の研究や、脊髄神経膠腫の免疫療法戦略の開発に特に価値があります。さらに、この方法は、脊髄神経膠腫の患者由来の異種移植モデルの作成に適しています。

このプロトコルは、マウスで脊髄神経膠腫移植モデルを作成するための、安全で技術的に単純で迅速に再現可能な手順を提案しています。このモデルは、神経膠腫の進行の根底にあるほとんど解明されていないメカニズムの研究を前進させ、脊髄神経膠腫の治療薬の開発を促進することが期待されます。

このプロトコルは、キャピタル医科大学の生物医学研究における動物ケアと治療の倫理に関する機関委員会(AEEI-2021-187)によって承認されたガイドラインに準拠して実施されました。この研究では、8週齢、体重19〜21gの雌C57BL/6マウスを使用しました。使用した試薬と機器は、 材料表に詳述されています。

1. 術前準備

1. すべての手術器具を徹底的に洗浄し、滅菌してください。
2. 手術台にアルコールをスプレーし、滅菌ペーパータオルできれいに拭きます。

2. 移植用GL261-lucおよびB16-F10-luc細胞の調製

注:GL261-luc GBM細胞株は市販され、B16-F10-lucメラノーマ細胞株はWang Xi教授からの贈り物でした。両細胞株とも、実験前の試験によりマイコプラズマ感染がないことが確認されました。

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン(100 U/mL)-ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加して、完全なDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)を調製します。
2. GL261-lucまたはB16-F10-luc細胞を完全なDMEM培地で培養し、対数成長期に細胞を採取して移植します。
3. 細胞を滅菌PBSで2回洗浄し、0.05%トリプシン-EDTA溶液と3分間インキュベートします。
4. 得られた細胞懸濁液をチューブに移し、室温で500 × g で5分間遠心分離します。
5. 遠心分離後、ピペットを使用して上清を捨て、細胞を滅菌PBSに再懸濁し、再度遠心分離します。
6. トリパンブルーで細胞を染色し、セルカウンターを使用して生存細胞をカウントします。
7. GL261-luc細胞の場合は5 × 10⁶ 細胞/mL、B16-F10-luc細胞の場合は5 × 10⁵ 細胞/mLの濃度で細胞懸濁液を調製し、すぐに使用できる状態にします。

3.動物の調理

1. 2.5%トリブロモエタノール溶液(10μL / g)の腹腔内注射により、マウスの体重を量り、麻酔をかけます。ペダル反射の喪失を確認して麻酔を確認します。準備から縫合までの全手順には、約5〜10分かかります。
   注意: 動物を加熱パッドの上に置いて、手順全体を通して体温を維持します。
2. 皮膚を露出させ、清潔な手術窓を準備します(図1A)。背側の首の部分と、正中線から両側に伸びる2cmの部分の毛をバリカンで剃ります。
   1. 残っている髪の毛を取り除くには、綿棒を使用して剃った部分に脱毛クリームの薄層を塗り、1〜2分間放置します。その後、石鹸で湿らせたガーゼで脱毛クリームを拭き取ります。
3. ヨウ素溶液を使用して皮膚を消毒し、円を描くように30秒間塗布した後、75%アルコールで拭いて脱ヨウ素化します。

4. 頸椎の露出と挿入点の決定

1. マウスの背側を上に向けてマウスを配置し、医療用テープを使用して手足を手術台に固定します。厚さ1〜2cmのガーゼパッドを首の部分の下に置き、サポートして、脊髄へのアクセスを改善します。
2. 外科用メスとブレードを使用して、首の皮膚に沿って約1.5cmの縦方向に切開します(図1B)。鈍骨解剖によって首の筋肉を優しく分離し、血管を傷つけないように注意します。
3. 頸椎に隣接する筋肉を慎重に解剖して、マウスの明確な骨のランドマークである7番目の頸椎棘突起を露出させます(図1Cおよび図1G-I)。
4. 注射を進める前に、滅菌綿棒を使用して手術部位から血液を取り除きます。
5. 穿刺点を脊椎の正中線から0.5〜0.9mmに設定し、マウスの体重(16〜24g)に基づいて注入深さを0.6〜0.9mmに調整します。
   注:脊髄注入深さは、体重22〜24gのマウスで0.9mmです。

5. 腫瘍細胞の注入

1. 10 μLフラットニードルシリンジを滅菌PBS溶液で2〜3回十分にすすいでください。
2. 2 μLの細胞懸濁液をシリンジに引き込み、気泡が存在しないことを確認します。
3. 頚椎の棘突起を鉗子で優しくつかんで持ち上げることにより、頚椎の棘突起を安定させます。斜めの針(長さ1.87 mm、直径0.48 mm)を使用して、硬膜に穴を開けます(図1D)。次に、フラットニードルシリンジ(直径0.48 mm)に切り替えて、腫瘍細胞を注入します(図1E)。
   注:穿刺部位は針の切り替え中も保持され、神経刺激による下肢のけいれんによって正確な配置が確認されます。
4. 細胞懸濁液をゆっくりと注入して、混乱を避けます。
5. 注射後30秒間シリンジを所定の位置に保ち、腫瘍の移植を確実に成功させます。

6. 術後ケア

1. 手術の最後に3-0ナイロン縫合糸で縫合することにより、皮膚切開を閉じます(図1F)。
2. マウスを横向きにして加熱マットの上に置くと、ケージ内での麻酔からの回復中に暖かさを維持し、安定した呼吸を確保できます。
3. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を1日2回皮下投与し、痛みを和らげます。.
4. マウスを監視して、出血や傷の裂傷の兆候なしに術前の活動を取り戻すことを確認します。
   注:後肢の衰弱を含む一時的な脊髄機能障害は、手術後に一般的であり、通常は3時間以内に解消します。マウスの約5%が麻痺を発症することがありますが、通常は3日以内に回復します。これらのマウスには、栄養的に完全な食事とケージの床に直接ゲル水を提供して、適切なアクセシビリティを確保します。対麻痺を経験するマウスのごく一部(約5%)は、安楽死を必要とする場合があります。
5. マウスが水と食物に継続的にアクセスできることを確認してください。
   注:動物が体重減少または麻痺の兆候を示している場合は、個別に飼育する必要があります。

7. 生体内 生物発光イメージング

1. D-PBSに溶解した150 mg / kgのD-ルシフェリンの腹腔内注射をマウスに投与します。.
2. マウスをイソフルランを含む麻酔チャンバーに入れて導入します。
3. 手術中に麻酔を維持するために、マウスを一体型麻酔マニホールドに移します。
4. 前報⁹で述べたin vivo生物発光イメージングを行う。
   注:小動物のライブイメージングにおけるD-ルシフェリンの最適な応答時間は、注射後10分です。イメージングが注入後10分で正確に行われることを確認してください。

脊髄神経膠腫の安定で信頼性の高い動物モデルを確立するために、C57BL/6マウスの第6頸椎と第7頸椎の間の椎間腔が、文献レビューと実験結果に基づいて接種に理想的な部位として特定された¹⁰。7番目の頸椎は、明確な骨のランドマークである棘突起(図1G-I)を提供し、注射部位を正確に特定し、注射プ?...

脊髄神経膠腫は、脊髄の原発性悪性腫瘍の最も一般的なタイプであり、髄内腫瘍の80%以上を占めています。病理学的には、脊髄神経膠腫は主に上衣腫または星状細胞腫に分類され、特に星状細胞腫¹¹に焦点が当てられています。星状細胞腫の中には、びまん性正中神経膠腫(DMG)とも呼ばれるH3K27M変異を持つものもあり、予後不良と関連しています。?...

利益相反は宣言されていません。

この研究は、中国国家自然科学基金会一般プログラム(基金番号8207317)の支援を受けました。北京市教育委員会の研究開発プログラム(基金番号。KZ202210025040)。中国医学研究所、北京(助成金番号。CX24PY08)。