JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي تطوير نموذج فئران قابل للتكرار للورم الدبقي في الحبل الشوكي عن طريق حقن الخلايا السرطانية في الفضاء الفقري ، مما يوفر نهجا أكثر فعالية وأقل توغلا للبحث والتطوير العلاجي.

Abstract

عادة ما تكون الأورام الدبقية في الحبل الشوكي أورام خبيثة في الحبل الشوكي ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل الإعاقة. ومع ذلك ، تظل إرشادات العلاج الموحدة والبيانات الشاملة عن الأورام الدبقية في الحبل الشوكي محدودة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية مناسبة قبل السريرية. أصبح تطوير نموذج حيواني بسيط وقابل للتكرار أمرا ضروريا للنهوض بالبحوث الأساسية والانتقالية. يعتبر نموذج الفئران مثاليا ، حيث يشترك الحبل الشوكي للفئران في أوجه التشابه الهيكلية مع الحبل الشوكي البشري. يصف هذا البروتوكول توليد نموذج فأر قابل للتكرار من الورم الدبقي في الحبل الشوكي عن طريق حقن الخلايا السرطانية مباشرة في الفضاء الفقري باستخدام العملية الشائكة للفقرة العنقية السابعة كدليل. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، فإن هذا النهج أكثر فعالية وملاءمة ، حيث يتضمن شقا أصغر ، وتقليل الغزو وفقدان الدم ، والتعافي بشكل أسرع ، وتكوين ورم أكثر استقرارا. من المتوقع أن يعزز هذا النموذج فهم آليات المرض ، ويحسن الاستراتيجيات الجراحية ، ويدعم تطوير الأدوية العلاجية للأورام الدبقية في الحبل الشوكي.

Introduction

الأورام الدبقية في الحبل الشوكي ، بما في ذلك تلك الموجودة في ذيل الفرس ، هي أورام خبيثة في الحبل الشوكي ، حيث تصنف 20٪ -40٪ على أنها أورام نجمية والباقي على أنها ورم البطانيالعصبي 1. بناء على السمات النسيجية ، يتم تصنيف الأورام الدبقية في الحبل الشوكي إلى أربع درجات (I-IV). تعتبر أورام الدرجة الأولى والثانية أورام دبقية منخفضة الدرجة ، بينما تصنف أورام الدرجة الثالثة والرابعة على أنها أورام دبقية عالية الدرجة. على الرغم من أن الأورام الدبقية في الحبل الشوكي يمكن أن تحدث في أي جزء من الحبل الشوكي ، إلا أنها توجد بشكل متكرر في منطقة عنق الرحم (33٪ من الحالات) وهي نادرة نسبيا في مناطق أخرى ، مع 26٪ من الحالات في المنطقة الصدرية و 24٪ في منطقة أسفل الظهر2.

الجراحة والعلاج الإشعاعي وعوامل الألكلة هي خيارات العلاج الأساسية للأورام الدبقية في الحبل الشوكي ، والتي تم استقراءها إلى حد كبير من التجارب السريرية على الأورام الدبقية في الدماغ3. ومع ذلك ، فقد أظهرت الأبحاث السابقة أنه على الرغم من أن الملامح النسيجية للأورام الدبقية في الحبل الشوكي تشبه تلك الموجودة في الأورام الدبقية في الدماغ ، إلا أن وجود التوقيعات الجزيئية المميزة يميزها عن نظيراتهاالدماغية 4. في مجموعتنا ، لم يستمد مرضى الورم الدبقي في الحبل الشوكي أي فائدة كبيرة من العلاج الكيميائي المساعد أو العلاج الإشعاعي ، مما يؤكد الفعالية المحدودة للعلاجات الحالية والحاجة إلى استراتيجيات علاجية جديدة5. لذلك ، تعتبر النماذج الحيوانية الموثوقة والغنية بالمعلومات ضرورية للنهوض بالأبحاث الأساسية والدراسات قبل السريرية.

حاليا ، توجد العديد من نماذج الورم الدبقي في الحبل الشوكي الراسخة ، بما في ذلك الطريقة التي وصفها Minru et al.6. تستخدم هذه النماذج بشكل أساسي تقنيات إزالة الفقرات الصدرية لفضح الحبل الشوكي6،7،8. على الرغم من استخدام نماذج الفئران في الماضي ، إلا أنها مرتبطة بتكاليف أعلى وأحجام عينات أصغر وتحديات إدارية أكبر مقارنة بنماذج الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر نماذج الفئران التجريبية المعدلة وراثيا أكثر من نماذج الفئران. يعد نموذج الفأر المختص بالمناعة ذا قيمة خاصة لدراسة الاستجابة المناعية داخل البيئة المكروية لورم العمود الفقري ولتطوير استراتيجيات العلاج المناعي للأورام الدبقية في الحبل الشوكي. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة مناسبة تماما لتوليد نماذج xenograft مشتقة من المريض للأورام الدبقية في الحبل الشوكي.

يقترح هذا البروتوكول إجراء آمنا وبسيطا تقنيا وقابلا للتكرار بسرعة لإنشاء نموذج زرع الورم الدبقي في الحبل الشوكي في الفئران. من المتوقع أن يعزز النموذج البحث في الآليات غير المستكشفة إلى حد كبير الكامنة وراء تطور الورم الدبقي ويسهل تطوير الأدوية العلاجية للأورام الدبقية في الحبل الشوكي.

Protocol

تم إجراء هذا البروتوكول وفقا للإرشادات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات رعاية وعلاجه في البحوث الطبية الحيوية في جامعة العاصمة الطبية (AEEI-2021-187). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع ووزنها 19-21 جم ، في هذه الدراسة. الكواشف والمعدات المستخدمة مفصلة في جدول المواد.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. تنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية جيدا.
  2. رش طاولة الجراحة بالكحول وامسحها باستخدام مناشف ورقية معقمة.

2. تحضير خلايا GL261-luc و B16-F10-luc للزرع

ملاحظة: تم الحصول على خط خلايا GL261-luc GBM تجاريا ، في حين أن خط خلايا الورم الميلانيني B16-F10-luc كان هدية من البروفيسور وانغ شي. تم تأكيد خلو كلا الخطين الخليين من عدوى الميكوبلازما من خلال الاختبارات قبل التجربة.

  1. قم بإعداد DMEM كامل (Dulbecco's Modified Eagle Medium) عن طريق استكماله بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين (100 وحدة / مل) ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).
  2. زراعة خلايا GL261-luc أو B16-F10-luc في وسط DMEM الكامل وجمع الخلايا خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي للزرع.
  3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المعقم ، ثم احتضنها بمحلول 0.05٪ trypsin-EDTA لمدة 3 دقائق.
  4. انقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الخلايا في PBS المعقم ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
  6. قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق واحسب الخلايا القابلة للحياة باستخدام عداد الخلايا.
  7. قم بإعداد معلق الخلية بتركيز 5 × 106 خلايا / مل لخلايا GL261-luc أو 5 × 105 خلايا / مل لخلايا B16-F10-luc ، مما يجعلها جاهزة للاستخدام.

3. تحضير

  1. قم بوزن الفئران وتخديرها عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول ثلاثي البروم الإيثانول بنسبة 2.5٪ (10 ميكرولتر / جم). تأكد من التخدير عن طريق التحقق من فقدان منعكس الدواسة. يجب أن يستغرق الإجراء بأكمله ، من التحضير إلى الخياطة ، حوالي 5-10 دقائق.
    ملاحظة: ضع على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم طوال العملية.
  2. كشف الجلد وإعداد نافذة جراحية نظيفة (الشكل 1 أ). احلق الشعر من منطقة الرقبة الظهرية ومنطقة 2 سم تمتد بشكل ثنائي من خط الوسط باستخدام مقصات الشعر.
    1. لإزالة أي شعر متبقي ، ضعي طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر على المناطق المحلوقة باستخدام قطعة قطن واتركيها لمدة 1-2 دقيقة. بعد ذلك ، امسح كريم إزالة الشعر بشاش مبلل بالصابون.
  3. تطهير الجلد باستخدام محلول اليود ، يوضع بحركة دائرية لمدة 30 ثانية ، متبوعا بالمسح بالكحول بنسبة 75٪ لإزالة اليود.

4. التعرض للعمود الفقري العنقي وتحديد نقطة الإدخال

  1. ضع الفئران بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى وقم بتثبيت أطرافها على طاولة الجراحة باستخدام شريط طبي. ضع وسادة شاش بسمك 1-2 سم أسفل منطقة الرقبة للحصول على الدعم ، مما يوفر وصولا أفضل إلى الحبل الشوكي.
  2. قم بعمل شق طولي بطول 1.5 سم تقريبا على طول جلد الرقبة باستخدام مشرط وشفرة جراحية (الشكل 1 ب). افصل عضلات الرقبة برفق عن طريق التشريح الحاد ، مع الحرص على تجنب إصابة أي أوعية دموية.
  3. قم بتشريح العضلات المجاورة لفقرات عنق الرحم بعناية لفضح العملية الشائكة للفقر العنقي السابع ، وهي معلم عظمي مميز في الفئران (الشكل 1C والشكل 1G-I).
  4. قم بمسح أي دم من منطقة الجراحة باستخدام مسحات قطنية معقمة قبل الشروع في الحقن.
  5. اضبط نقطة الثقب على 0.5-0.9 مم من خط الوسط للعمود الفقري ، واضبط عمق الحقن على 0.6-0.9 مم بناء على وزن جسم الفئران (16-24 جم).
    ملاحظة: عمق حقن الحبل الشوكي 0.9 مم للفئران التي تزن 22-24 جم.

5. حقن الخلايا السرطانية

  1. اشطف حقنة إبرة مسطحة سعة 10 ميكرولتر جيدا بمحلول PBS معقم 2-3 مرات.
  2. اسحب 2 ميكرولتر من تعليق الخلية في المحقنة ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
  3. قم بتثبيت العملية الشائكة للفقر العنقي عن طريق الإمساك بها برفق ورفعها باستخدام الملقط. استخدم إبرة مشطوفة (طولها 1.87 مم وقطرها 0.48 مم) لثقب الأم الجافية (الشكل 1 د). بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى حقنة إبرة مسطحة (قطرها 0.48 مم) لحقن الخلايا السرطانية (الشكل 1E).
    ملاحظة: يتم الحفاظ على موقع البزل أثناء تبديل الإبرة ، مع تأكيد الموضع الدقيق عن طريق ارتعاش الطرف السفلي من تحفيز العصب.
  4. حقن معلق الخلية ببطء لتجنب الاضطراب.
  5. احتفظ بالحقنة في مكانها لمدة 30 ثانية بعد الحقن لضمان نجاح زرع الورم.

6. رعاية ما بعد الجراحة

  1. أغلق شق الجلد عن طريق الخياطة بخياطة نايلون 3-0 في نهاية العملية (الشكل 1F).
  2. ضع الماوس على جانبه وضعه على حصيرة ساخنة للحفاظ على الدفء وضمان التنفس المستقر أثناء التعافي من التخدير في القفص.
  3. تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد مرتين يوميا لمدة 3 أيام لتخفيف الألم.
  4. راقب الفأر للتأكد من أنه يستعيد نشاطه قبل الجراحة دون علامات النزيف أو تمزق الجرح.
    ملاحظة: يعد الخلل الوظيفي المؤقت في الحبل الشوكي ، بما في ذلك ضعف الطرف الخلفي ، أمرا شائعا بعد الجراحة وعادة ما يزول في غضون 3 ساعات. قد يصاب ما يقرب من 5٪ من الفئران بالشلل ولكنها عادة ما تتعافى في غضون 3 أيام. بالنسبة لهذه الفئران ، قم بتوفير نظام غذائي كامل من الناحية التغذوية وماء جل مباشرة على أرضية القفص لضمان إمكانية الوصول الكافي. قد تتطلب نسبة صغيرة (حوالي 5٪) من الفئران التي تعاني من الشلل النصفي القتل الرحيم.
  5. تأكد من حصول الفئران على الماء والطعام باستمرار.
    ملاحظة: إذا ظهرت على علامات فقدان الوزن أو الشلل ، فيجب إيواؤها بشكل فردي.

7. في الجسم الحي تصوير التلألؤ البيولوجي

  1. تطبيق حقنة داخل الصفاق بمقدار 150 ملغ/كغ D-luciferin المذاب في D-PBS للفئران.
  2. ضع الفئران في غرفة تخدير تحتوي على الأيزوفلوران للتحريض.
  3. انقل الفئران إلى مشعب التخدير المتكامل للحفاظ على التخدير أثناء العملية.
  4. إجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي كما هو موضح في التقريرالسابق 9.
    ملاحظة: وقت الاستجابة الأمثل ل D-luciferin في التصوير الحي للحيوانات الصغيرة هو 10 دقائق بعد الحقن. تأكد من إجراء التصوير بدقة بعد 10 دقائق من الحقن.

النتائج

لإنشاء نموذج حيواني مستقر وموثوق به للورم الدبقي الشوكي ، تم تحديد الفراغ الفقري بين الفقرات العنقية السادسة والسابعة في الفئران C57BL / 6 كموقع مثالي للتلقيح بناء على مراجعة الأدبيات والنتائج التجريبية10. توفر الفقرة العنقية السابعة معلما عظميا مميزا ، وهي ال...

Discussion

الورم الدبقي في الحبل الشوكي هو النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة الأولية في النخاع الشوكي ، وهو يمثل أكثر من 80٪ من الأورام داخل النخاع. من الناحية المرضية ، تصنف الأورام الدبقية في الحبل الشوكي في المقام الأول على أنها ورم البطاني العصبي أو الأورام النجمية ، مع التر...

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (الصندوق رقم 8207317). برنامج البحث والتطوير للجنة التعليم في بلدية بكين (رقم الصندوق. KZ202210025040). المعاهد الصينية للبحوث الطبية، بيجين (منحة رقم. CX24PY08).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)Bio-ServN/A
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jacksonimmuno115-007-003
B16-F10-lucProfessor Wang Xi's laboratoryN/A
Buprenorphine Related Compound ASigma-Aldrich457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAbImmunowayYM6146
CD86 rabbit pAbImmunowayYT7823
Cell counterBio-rad1450102
Cell Counting SlidesBiorad1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)ImmunowayYS0014
DilatorJinzhongD22178
D-LuciferinPerkinElmer122799
DMEMGibcoC11995500BT
D-PBSSolarbioD1040
Fetal Bovine Serum, qualifiedGibco10270-106
GL261-lucShanghai Zishi BiotechnologyN/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647LifeA21244
Goat SerumBeyotimeC0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701NHamilton80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)PerkinElmerN/A
MethanolFuyu Chemical67-56-1
Micro ScissorsJinzhongWAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)Shanghai GaogeN/A
Microscope cover glassCITOTEST10212440C
needle holder 12.5 cmJinzhongJCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cmJinzhongJD1060
Ophthalmic Scissors 10 cmJinzhongY00030
PBS, 10×SolarbioP1022
Penicillin-Streptomycin LiquidSolarbioP1400
Scalpel BladesJinzhongJ0B050
super pap penZSGB-BioZLI-9303
Surgical Knife HandleJinzhongJ11010
Surgical scissors 12.5cm straight tipJinzhongJ21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0UNIFYN/A
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSAKURA4583
TribromoethanolSigma-AldrichT48402
Triton X-100ServicebioGC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%SolarbioC0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)SolarbioT1350
Tween-20SolarbioT8220

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2015-2019. Neuro Oncol. 24 (Suppl 5), v1-v95 (2022).
  2. Kane, P. J., el-Mahdy, W., Singh, A., Powell, M. P., Crockard, H. A. Spinal intradural tumours: Part II--Intramedullary. Br J Neurosurg. 13 (6), 558-563 (1999).
  3. Horbinski, C., et al. NCCN guidelines insights: Central Nervous System Cancers, Version 2.2022. J Natl Compr Canc Netw. 21 (1), 12-20 (2023).
  4. Chai, R. C., et al. The molecular characteristics of spinal cord gliomas with or without H3 K27M mutation. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 40 (2020).
  5. Zhang, Y. W., et al. Clinicopathological characteristics and survival of spinal cord astrocytomas. Cancer Med. 9 (19), 6996-7006 (2020).
  6. Muir, D., et al. Assessment of laminin-mediated glioma invasion in vitro and by glioma tumors engrafted within rat spinal cord. J Neurooncol. 30 (3), 199-211 (1996).
  7. Ren, T. J., et al. Establishment of intramedullary spinal cord glioma model in rats. Chin Med J (Engl). 123 (18), 2580-2585 (2010).
  8. Hsu, W., et al. Animal model of intramedullary spinal cord glioma using human glioblastoma multiforme neurospheres. J Neurosurg Spine. 16 (3), 315-319 (2012).
  9. Lim, E., et al. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), e1210 (2009).
  10. Weng, Z., et al. A reproduceable in situ xenograft model of spinal glioma. J Neurosci Methods. 346, 108928 (2020).
  11. Chamberlain, M. C., Tredway, T. L. Adult primary intradural spinal cord tumors: a review. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 320-328 (2011).
  12. Watanabe, G., et al. Diffuse Midline H3K27-Altered Gliomas in the Spinal Cord: A Systematic Review. J Neurooncol. 166 (3), 379-394 (2024).
  13. Chalif, E. J., et al. Impact of extent of resection and adjuvant therapy in diffuse gliomas of the spine. Spine J. 23 (7), 1015-1027 (2023).
  14. Ellis, J. A., et al. Unique microenvironmental responses to PDGF stimulation in brain and spinal cord gliomas determine tumor phenotype. J Neurooncol. 123 (1), 27-33 (2015).
  15. Zhou, D., et al. Harnessing immunotherapy for brain metastases: insights into tumor-brain microenvironment interactions and emerging treatment modalities. J Hematol Oncol. 16 (1), 121 (2023).
  16. Sampson, J. H., Gunn, M. D., Fecci, P. E., Ashley, D. M. Brain immunology and immunotherapy in brain tumours. Nat Rev Cancer. 20 (1), 12-25 (2020).
  17. Jha, P., et al. Analysis of PD-L1 expression and T cell infiltration in different molecular subgroups of diffuse midline gliomas. Neuropathology. 39 (6), 413-424 (2019).
  18. Majzner, R. G., et al. GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas. Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).
  19. Cossigny, D. A. F., Mouhtouris, E., Dushyanthen, S., Gonzalvo, A., Quan, G. M. Y. An in vivo mouse model of intraosseous spinal cancer causing evolving paraplegia. J Neurooncol. 115 (2), 189-196 (2013).
  20. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. (53), e2834 (2011).
  21. Minehan, K. J., Brown, P. D., Scheithauer, B. W., Krauss, W. E., Wright, M. P. Prognosis and treatment of spinal cord astrocytoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 73 (3), 727-733 (2009).
  22. Feng, S., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. J Vis Exp. (187), e64538 (2022).
  23. Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25 (19), 4694-4705 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved