Transplantation chirurgicale de cellules tumorales dans la moelle épinière de souris

Le présent protocole décrit le développement d’un modèle murin reproductible de gliome de la moelle épinière en injectant des cellules tumorales dans l’espace intervertébral, offrant une approche plus efficace et moins invasive pour la recherche et le développement thérapeutique.

Les gliomes de la moelle épinière sont généralement des tumeurs malignes de la moelle épinière, entraînant un taux élevé d’invalidité. Cependant, les directives de traitement uniformes et les données complètes sur les gliomes de la moelle épinière restent limitées en raison du manque de modèles animaux précliniques appropriés. Développer un modèle animal simple et reproductible est devenu essentiel pour faire avancer la recherche fondamentale et translationnelle. Un modèle murin est idéal, car la moelle épinière murine partage des similitudes structurelles avec la moelle épinière humaine. Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin reproductible de gliome de la moelle épinière en injectant directement des cellules tumorales dans l’espace intervertébral en utilisant l’apophyse épineuse de la septième vertèbre cervicale comme guide. Par rapport à d’autres méthodes, cette approche est plus efficace et plus pratique, impliquant une incision plus petite, une réduction de l’invasivité et de la perte de sang, une récupération plus rapide et une formation tumorale plus stable. Ce modèle devrait faire progresser la compréhension des mécanismes de la maladie, optimiser les stratégies chirurgicales et soutenir le développement de médicaments thérapeutiques pour les gliomes de la moelle épinière.

Les gliomes de la moelle épinière, y compris ceux de la queue de cheval, sont généralement des néoplasmes malins de la moelle épinière, 20 à 40 % étant classés comme astrocytomes et le reste comme épendymomes¹. Sur la base des caractéristiques histologiques, les gliomes de la moelle épinière sont classés en quatre grades (I-IV). Les tumeurs de grade I et II sont considérées comme des gliomes de bas grade, tandis que les tumeurs de grade III et IV sont classées comme gliomes de haut grade. Bien que les gliomes de la moelle épinière puissent survenir dans n’importe quel segment de la moelle épinière, ils sont le plus souvent trouvés dans la région cervicale (33 % des cas) et sont relativement rares dans d’autres régions, avec 26 % des cas dans la région thoracique et 24 % dans la région lombaire².

La chirurgie, la radiothérapie et les agents alkylants sont les principales options de traitement des gliomes de la moelle épinière, largement extrapolées à partir d’essais cliniques sur les gliomes cérébraux³. Cependant, des recherches antérieures ont démontré que, bien que les profils histologiques des gliomes de la moelle épinière ressemblent à ceux des gliomes cérébraux, la présence de signatures moléculaires distinctes les différencie de leurs homologues cérébraux⁴. Dans notre cohorte, les patients atteints de gliome de la moelle épinière n’ont tiré aucun bénéfice significatif de la chimiothérapie adjuvante ou de la radiothérapie, soulignant l’efficacité limitée des traitements actuels et la nécessité de nouvelles stratégies thérapeutiques⁵. Par conséquent, des modèles animaux fiables et informatifs sont essentiels pour faire progresser la recherche fondamentale et les études précliniques.

À l’heure actuelle, il existe plusieurs modèles bien établis de gliome de la moelle épinière, y compris la méthode décrite par Minru et ^al.6. Ces modèles utilisent principalement des techniques d’ablation des vertèbres thoraciques pour exposer la moelle épinière ^6,7,8. Bien que des modèles de rats aient été utilisés dans le passé, ils sont associés à des coûts plus élevés, à des échantillons de plus petite taille et à des défis de gestion plus importants par rapport aux modèles murins. De plus, il existe plus de modèles expérimentaux de souris génétiquement modifiés que de modèles de rats. Un modèle murin immunocompétent est particulièrement précieux pour étudier la réponse immunitaire dans le microenvironnement de la tumeur vertébrale et pour développer des stratégies immunothérapeutiques pour les gliomes de la moelle épinière. De plus, cette méthode est bien adaptée pour générer des modèles de xénogreffes dérivées de patients pour les gliomes de la moelle épinière.

Ce protocole propose une procédure sûre, techniquement simple et rapidement reproductible pour la création d’un modèle de greffe de gliome de la moelle épinière chez la souris. Le modèle devrait faire progresser la recherche sur les mécanismes largement inexplorés qui sous-tendent la progression du gliome et faciliter le développement de médicaments thérapeutiques pour les gliomes de la moelle épinière.

Ce protocole a été mené dans le respect des lignes directrices approuvées par le Comité institutionnel pour l’éthique des soins et du traitement des animaux dans la recherche biomédicale de la Capital Medical University (AEEI-2021-187). Des souris femelles C57BL/6, âgées de 8 semaines et pesant de 19 à 21 g, ont été utilisées dans cette étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont détaillés dans la table des matériaux.

1. Préparation préopératoire

1. Nettoyez et stérilisez soigneusement tous les instruments chirurgicaux.
2. Vaporisez la table d’opération avec de l’alcool et essuyez-la à l’aide d’essuie-tout stériles.

2. Préparation des cellules GL261-luc et B16-F10-luc pour la transplantation

REMARQUE : La lignée cellulaire GL261-luc GBM a été obtenue commercialement, tandis que la lignée cellulaire de mélanome B16-F10-luc a été offerte par le professeur Wang Xi. Il a été confirmé que les deux lignées cellulaires étaient exemptes d’infection à mycoplasmes par des tests préexpérimentaux.

1. Préparez du DMEM complet (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) en le complétant avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 μg/mL).
2. Cultivez des cellules GL261-luc ou B16-F10-luc dans le milieu DMEM complet et collectez des cellules pendant la phase de croissance logarithmique pour l’implantation.
3. Lavez les cellules deux fois avec du PBS stérile, puis incubez-les avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min.
4. Transvasez la suspension cellulaire obtenue dans un tube et centrifugez à 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
5. Après la centrifugation, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans du PBS stérile et centrifuger à nouveau.
6. Colorez les cellules avec du bleu trypan et comptez les cellules viables à l’aide d’un compteur de cellules.
7. Préparez la suspension cellulaire à une concentration de 5 × 10⁶ cellules/mL pour les cellules GL261-luc ou 5 × 10⁵ cellules/mL pour les cellules B16-F10-luc, afin de la rendre prête à l’emploi.

3. Préparation des animaux

1. Peser et anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’une solution de tribromoéthanol à 2,5 % (10 μL/g). Confirmez l’anesthésie en vérifiant la perte du réflexe de la pédale. L’ensemble de la procédure, de la préparation à la suture, devrait prendre environ 5 à 10 minutes.
   REMARQUE : Placez l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle tout au long de la procédure.
2. Exposez la peau et préparez une fenêtre chirurgicale propre (Figure 1A). Rasez les poils de la région dorsale du cou et d’une zone de 2 cm s’étendant bilatéralement à partir de la ligne médiane à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
   1. Pour enlever les poils restants, appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur les zones rasées à l’aide d’un coton-tige et laissez-la agir pendant 1 à 2 minutes. Ensuite, essuyez la crème dépilatoire avec de la gaze imbibée de savon.
3. Désinfectez la peau à l’aide d’une solution d’iode, appliquée en mouvements circulaires pendant 30 s, suivie d’un essuyage avec de l’alcool à 75 % pour la déiodation.

4. Exposition de la colonne cervicale et détermination du point d’insertion

1. Positionnez les souris avec leur côté dorsal vers le haut et fixez leurs membres à la table d’opération à l’aide de ruban adhésif. Placez un tampon de gaze de 1 à 2 cm d’épaisseur sous la zone du cou pour le soutenir, offrant un meilleur accès à la moelle épinière.
2. Faites une incision longitudinale d’environ 1,5 cm le long de la peau du cou à l’aide d’un scalpel chirurgical et d’une lame (figure 1B). Séparez doucement les muscles du cou par dissection émoussée, en prenant soin d’éviter de blesser les vaisseaux sanguins.
3. Disséquez soigneusement les muscles adjacents aux vertèbres cervicales pour exposer le septième apophyse épineuse vertébrale cervicale, un point de repère osseux distinct chez la souris (Figure 1C et Figure 1G-I).
4. Éliminez le sang de la zone chirurgicale à l’aide de cotons-tiges stériles avant de procéder à l’injection.
5. Réglez le point de ponction à 0,5-0,9 mm de la ligne médiane de la colonne vertébrale, en ajustant la profondeur d’injection à 0,6-0,9 mm en fonction du poids corporel des souris (16-24 g).
   REMARQUE : La profondeur d’injection de la moelle épinière est de 0,9 mm pour les souris pesant 22-24 g.

5. Injection de cellules tumorales

1. Rincer abondamment une seringue à aiguille plate de 10 μL avec une solution stérile de PBS 2 à 3 fois.
2. Aspirez 2 μL de la suspension cellulaire dans la seringue, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.
3. Stabilisez l’apophyse vertébrale cervicale en la saisissant doucement et en la soulevant à l’aide d’une pince. À l’aide d’une aiguille biseautée (1,87 mm de longueur et 0,48 mm de diamètre), percez la dure-mère (figure 1D). Ensuite, passez à une seringue à aiguille plate (0,48 mm de diamètre) pour injecter les cellules tumorales (Figure 1E).
   REMARQUE : Le site de ponction est préservé lors du changement d’aiguille, le placement précis étant confirmé par les contractions des membres inférieurs dues à la stimulation nerveuse.
4. Injectez lentement la suspension cellulaire pour éviter toute perturbation.
5. Gardez la seringue en place pendant 30 secondes après l’injection pour assurer une implantation tumorale réussie.

6. Soins post-chirurgicaux

1. Fermer l’incision cutanée en suturant avec une suture en nylon 3-0 à la fin de l’opération (Figure 1F).
2. Positionnez la souris sur le côté et placez-la sur un tapis chauffant pour maintenir la chaleur et assurer une respiration stable pendant la récupération de l’anesthésie dans la cage.
3. Administrer la buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée deux fois par jour pendant 3 jours pour soulager la douleur.
4. Surveillez la souris pour vous assurer qu’elle retrouve son activité préopératoire sans signe de saignement ou de déchirure de la plaie.
   REMARQUE : Un dysfonctionnement temporaire de la moelle épinière, y compris une faiblesse des membres postérieurs, est fréquent après la chirurgie et disparaît généralement dans les 3 heures. Environ 5 % des souris peuvent développer une paralysie, mais se rétablissent généralement dans les 3 jours. Pour ces souris, fournissez un régime alimentaire complet sur le plan nutritionnel et de l’eau en gel directement sur le sol de la cage pour assurer une accessibilité adéquate. Un petit pourcentage (environ 5 %) de souris paraplégiques peut nécessiter l’euthanasie.
5. Assurez-vous que les souris ont un accès continu à l’eau et à la nourriture.
   REMARQUE : Si les animaux présentent des signes de perte de poids ou de paralysie, ils doivent être logés individuellement.

7. Imagerie par bioluminescence in vivo

1. Administrer une injection intrapéritonéale de 150 mg/kg de D-luciférine dissoute dans du D-PBS aux souris.
2. Placez les souris dans une chambre d’anesthésie contenant de l’isoflurane pour l’induction.
3. Transférez les souris dans le collecteur d’anesthésie intégrale pour maintenir l’anesthésie pendant la procédure.
4. Effectuer l’imagerie bioluminescente in vivo comme décrit dans le rapport précédent⁹.
   REMARQUE : Le temps de réponse optimal pour la D-luciférine dans l’imagerie en direct de petits animaux est de 10 minutes après l’injection. Assurez-vous que l’imagerie est effectuée avec précision 10 minutes après l’injection.

Afin d’établir un modèle animal stable et fiable de gliome spinal, l’espace intervertébral entre la sixième et la septième vertèbre cervicale chez les souris C57BL/6 a été identifié comme le site idéal pour l’inoculation sur la base d’une revue de la littérature et des résultats expérimentaux¹⁰. La septième vertèbre cervicale fournit un point de repère osseux distinct, l’apophyse épineuse (figure 1G-I

Le gliome de la moelle épinière est le type le plus courant de tumeur maligne primitive de la moelle épinière, représentant plus de 80 % des tumeurs intramédullaires. Sur le plan pathologique, les gliomes de la moelle épinière sont principalement classés comme épendymomes ou astrocytomes, avec un accent particulier sur les astrocytomes¹¹. Parmi les astrocytomes, certains hébergent des mutations H3K27M, également appelées gliomes diffus de la ligne mé...

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Ce travail a été soutenu par le programme général de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Fonds n° 8207317). Programme de R&D de la Commission municipale de l’éducation de Pékin (Fonds n° KZ202210025040). Instituts chinois de recherche médicale, Pékin (Subvention n° CX24PY08).