肿瘤细胞手术移植到小鼠脊髓中

本方案描述了通过将肿瘤细胞注射到椎间隙来开发可重复的脊髓神经胶质瘤小鼠模型，为研究和治疗开发提供了一种更有效和侵入性更小的方法。

脊髓神经胶质瘤通常是脊髓的恶性肿瘤，导致高残疾率。然而，由于缺乏合适的临床前动物模型，关于脊髓神经胶质瘤的统一治疗指南和综合数据仍然有限。开发一种简单且可重复的动物模型对于推进基础和转化研究至关重要。小鼠模型是理想的，因为小鼠脊髓与人类脊髓在结构上具有相似性。该方案描述了通过使用第七颈椎的棘突作为指导，将肿瘤细胞直接注射到椎间隙来产生可重复的脊髓神经胶质瘤小鼠模型。与其他方法相比，这种方法更有效、更方便，切口更小，侵入性和失血量减少，恢复更快，肿瘤形成更稳定。该模型有望促进对疾病机制的理解，优化手术策略，并支持脊髓胶质瘤治疗药物的开发。

脊髓胶质瘤，包括马尾神经胶质瘤，通常是脊髓的恶性肿瘤，其中 20%-40% 被归类为星形细胞瘤，其余被归类为室管膜瘤¹。根据组织学特征，脊髓胶质瘤分为四个等级 （I-IV）。I 级和 II 级肿瘤被认为是低级别神经胶质瘤，而 III 级和 IV 级肿瘤被归类为高级别神经胶质瘤。虽然脊髓胶质瘤可以发生在脊髓的任何节段，但它们最常见于颈部区域（33% 的病例），在其他区域相对罕见，26% 的病例在胸部区域，24% 的病例在腰部²。

手术、放疗和烷化剂是脊髓神经胶质瘤的主要治疗选择，主要从脑胶质瘤的临床试验中推断出来³。然而，先前的研究表明，尽管脊髓神经胶质瘤的组织学特征与脑神经胶质瘤相似，但不同分子特征的存在使它们与大脑神经胶质瘤区分开来⁴。在我们的队列中，脊髓胶质瘤患者没有从辅助化疗或放疗中获得显着益处，这凸显了当前治疗的有效性有限，需要新的治疗策略⁵。因此，可靠且信息丰富的动物模型对于推进基础研究和临床前研究至关重要。

目前，存在几种成熟的脊髓神经胶质瘤模型，包括 Minru 等人描述的方法⁶。这些模型主要利用胸椎切除技术来暴露脊髓 ^6,7,8。尽管过去曾采用大鼠模型，但与小鼠模型相比，它们与更高的成本、更小的样本量和更大的管理挑战有关。此外，与大鼠模型相比，可以使用更多的转基因实验小鼠模型。免疫功能正常的小鼠模型对于研究脊髓肿瘤微环境中的免疫反应和开发脊髓胶质瘤的免疫治疗策略特别有价值。此外，该方法非常适合为脊髓神经胶质瘤生成患者来源的异种移植模型。

该协议提出了一种安全、技术简单且可快速重复的程序，用于在小鼠中创建脊髓神经胶质瘤移植模型。该模型有望推进对神经胶质瘤进展基本未被探索的机制的研究，并促进脊髓神经胶质瘤治疗药物的开发。

该协议是根据首都医科大学生物医学研究中动物护理和治疗伦理机构委员会 （AEEI-2021-187） 批准的指南进行的。本研究使用雌性 C57BL/6 小鼠，年龄 8 周龄，体重 19-21 g。材料 表中详细介绍了所使用的试剂和设备。

1. 术前准备

1. 彻底清洁和消毒所有手术器械。
2. 用酒精喷洒手术台，然后用无菌纸巾擦拭干净。

2. 用于移植的 GL261-luc 和 B16-F10-luc 细胞的制备

注：GL261-luc GBM 细胞系是商业获得的，而 B16-F10-luc 黑色素瘤细胞系是王习教授的礼物。通过实验前测试确认两种细胞系均无支原体感染。

1. 通过补充 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素 （100 U/mL） - 链霉素 （100 μg/mL） 来制备完整的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）。
2. 在完整的 DMEM 培养基中培养 GL261-luc 或 B16-F10-luc 细胞，并在对数生长期收集细胞以进行植入。
3. 用无菌 PBS 洗涤细胞两次，然后用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育 3 分钟。
4. 将所得细胞悬液转移到试管中，并在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。
5. 离心后，用移液管弃去上清液，将细胞重悬于无菌 PBS 中，然后再次离心。
6. 用台盼蓝对细胞进行染色，并使用细胞计数器对活细胞进行计数。
7. 为 GL261-luc 细胞制备浓度为 5 ×^{10 6} 个细胞/mL 的细胞悬液，对于 B16-F10-luc 细胞，制备浓度为 5 × 10⁵ 个细胞/mL，以备可用。

3. 动物准备

1. 通过腹膜内注射 2.5% 三溴乙醇溶液 （10 μL/g） 对小鼠进行称重和麻醉。通过检查踏板反射是否消失来确认麻醉。从准备到缝合的整个过程大约需要 5-10 分钟。
   注意：将动物放在加热垫上，以在整个过程中保持体温。
2. 暴露皮肤并准备一个干净的手术窗（图 1A）。使用理发器剃掉颈部背侧区域和从中线双侧延伸的 2 厘米区域的头发。
   1. 要去除任何残留的毛发，请使用棉签在剃光的区域涂抹一层薄薄的脱毛霜，然后放置 1-2 分钟。然后，用肥皂湿纱布擦去脱毛膏。
3. 使用碘溶液对皮肤进行消毒，以圆周运动涂抹 30 秒，然后用 75% 酒精擦拭以进行脱碘。

4. 颈椎暴露和插入点的确定

1. 将小鼠的背侧朝上放置，并使用医用胶带将其四肢固定在手术台上。在颈部区域下方放置 1-2 厘米厚的纱布垫作为支撑，更好地进入脊髓。
2. 使用手术刀和刀片沿颈部皮肤做一个约 1.5 厘米的纵向切口（图 1B）。通过钝器解剖轻轻分离颈部肌肉，注意避免损伤任何血管。
3. 仔细解剖颈椎附近的肌肉，露出第七颈椎棘突，这是小鼠的一个明显的骨标志（图 1C 和图 1G-I）。
4. 在进行注射之前，使用无菌棉签清除手术区域的所有血液。
5. 将穿刺点设置在距脊柱中线 0.5-0.9 毫米处，根据小鼠的体重 （16-24 g） 将注射深度调整为 0.6-0.9 毫米。
   注：体重 0.9-22 g 的小鼠脊髓注射深度为 24 mm。

5. 肿瘤细胞注射

1. 用无菌 PBS 溶液彻底冲洗 10 μL 平针注射器 2-3 次。
2. 将 2 μL 细胞悬液吸入注射器中，确保不存在气泡。
3. 通过轻轻抓住并用镊子提起颈椎棘突来稳定它。使用斜面针（长度 1.87 毫米，直径 0.48 毫米）刺穿硬脑膜（图 1D）。然后，切换到平针注射器（直径 0.48 毫米）注射肿瘤细胞（图 1E）。
   注意：穿刺部位在换针期间保留，神经刺激引起的下肢抽搐证实了准确的位置。
4. 缓慢注射细胞悬液以避免中断。
5. 注射后将注射器保持在原位 30 秒，以确保肿瘤成功植入。

6. 术后护理

1. 在手术结束时用 3-0 尼龙缝合线缝合皮肤切口（图 1F）。
2. 将鼠标侧放并放在加热的垫子上，以保持温暖并确保在笼内麻醉恢复期间呼吸稳定。
3. 丁丙诺啡 （0.1 mg/kg） 皮下注射，每天两次，持续 3 天以减轻疼痛。
4. 监测鼠标以确保其恢复术前活动，没有出血或伤口撕裂的迹象。
   注意：暂时性脊髓功能障碍，包括后肢无力，在手术后很常见，通常在 3 小时内消退。大约 5% 的小鼠可能会出现麻痹，但通常会在 3 天内恢复。对于这些小鼠，直接在笼子地板上提供营养全面的饮食和凝胶水，以确保足够的可及性。一小部分 （约 5%） 经历截瘫的小鼠可能需要安乐死。
5. 确保小鼠能够持续获得水和食物。
   注意：如果动物出现体重减轻或瘫痪的迹象，则应单独饲养它们。

7. 体内 生物发光成像

1. 向小鼠腹膜内注射溶于 D-PBS 中的 150 mg/kg D-荧光素。
2. 将小鼠置于含有异氟醚的麻醉室中进行诱导。
3. 将小鼠转移到整体麻醉歧管中，以在手术过程中保持麻醉。
4. 如上一份报告⁹ 中所述进行体内生物发光成像。
   注意：D-荧光素在小动物实时成像中的最佳响应时间是注射后 10 分钟。确保在注射后 10 分钟精确进行成像。

为建立稳定可靠的脊髓神经胶质瘤动物模型，根据文献回顾和实验结果，确定 C57BL/6 小鼠第六和第七颈椎之间的椎间隙为理想的接种部位¹⁰。第七颈椎提供了一个独特的骨骼标志，即棘突（图 1G-I），这有助于准确定位注射部位并稳定注射过程。

小鼠的颈部区域包含许多肌肉和血管，?...

脊髓胶质瘤是脊髓中最常见的原发性恶性肿瘤类型，占髓内肿瘤的 80% 以上。在病理学上，脊髓神经胶质瘤主要分为室管膜瘤或星形细胞瘤，特别关注星形细胞瘤¹¹。在星形细胞瘤中，一些携带 H3K27M 突变，也称为弥漫性中线胶质瘤 （DMG），这与预后不良有关。脊髓胶质瘤的一个决定性特征是其浸润性生长模式，由于肿瘤与周围健康组织之间缺乏明确的?...

没有宣布利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金面上项目（基金编号 8207317）的支持。北京市教委研发计划（基金号）KZ202210025040）。中国医学研究院，北京 （Grant No.CX24PY08）。