Trasplante quirúrgico de células tumorales en la médula espinal de ratones

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo murino reproducible de glioma de médula espinal mediante la inyección de células tumorales en el espacio intervertebral, ofreciendo un enfoque más eficaz y menos invasivo para la investigación y el desarrollo terapéutico.

Los gliomas de la médula espinal suelen ser tumores malignos de la médula espinal que provocan una alta tasa de discapacidad. Sin embargo, las pautas de tratamiento uniformes y los datos completos sobre los gliomas de médula espinal siguen siendo limitados debido a la falta de modelos animales preclínicos adecuados. El desarrollo de un modelo animal simple y reproducible se ha vuelto esencial para avanzar en la investigación básica y traslacional. Un modelo murino es ideal, ya que la médula espinal murina comparte similitudes estructurales con la médula espinal humana. Este protocolo describe la generación de un modelo murino reproducible de glioma de médula espinal mediante la inyección directa de células tumorales en el espacio intervertebral utilizando la apófisis espinosa de la séptima vértebra cervical como guía. En comparación con otros métodos, este enfoque es más eficaz y conveniente, ya que implica una incisión más pequeña, una menor invasividad y pérdida de sangre, una recuperación más rápida y una formación de tumores más estable. Se espera que este modelo avance en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, optimice las estrategias quirúrgicas y apoye el desarrollo de fármacos terapéuticos para los gliomas de la médula espinal.

Los gliomas de la médula espinal, incluidos los de la cola de caballo, suelen ser neoplasias malignas de la médula espinal, con un 20-40% clasificado como astrocitomas y el resto como ependimomas¹. Según las características histológicas, los gliomas de médula espinal se clasifican en cuatro grados (I-IV). Los tumores de grado I y II se consideran gliomas de grado bajo, mientras que los tumores de grado III y IV se clasifican como gliomas de grado alto. Aunque los gliomas de la médula espinal pueden presentarse en cualquier segmento de la médula espinal, se encuentran con mayor frecuencia en la región cervical (33 % de los casos) y son relativamente raros en otras regiones, con 26 % de los casos en la región torácica y 24 % en la región lumbar².

La cirugía, la radioterapia y los alquilantes son las principales opciones de tratamiento para los gliomas de médula espinal, extrapoladas en gran medida de los ensayos clínicos sobre gliomas cerebrales³. Sin embargo, investigaciones previas han demostrado que, aunque los perfiles histológicos de los gliomas de médula espinal se asemejan a los de los gliomas cerebrales, la presencia de firmas moleculares distintas los diferencia de sus contrapartes cerebrales⁴. En nuestra cohorte, los pacientes con glioma medular no obtuvieron ningún beneficio significativo de la quimioterapia adyuvante ni de la radioterapia, lo que subraya la limitada efectividad de los tratamientos actuales y la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas⁵. Por lo tanto, los modelos animales fiables e informativos son esenciales para avanzar en la investigación básica y los estudios preclínicos.

En la actualidad, existen varios modelos de glioma medular bien establecidos, incluyendo el método descrito por Minru et ^al.6. Estos modelos utilizan principalmente técnicas de extirpación de vértebras torácicas para exponer la médula espinal ^6,7,8. Aunque los modelos de ratas se han empleado en el pasado, se asocian con costos más altos, tamaños de muestra más pequeños y mayores desafíos de manejo en comparación con los modelos de ratón. Además, hay más modelos experimentales de ratones modificados genéticamente que modelos de ratas. Un modelo de ratón inmunocompetente es particularmente valioso para estudiar la respuesta inmunitaria dentro del microambiente del tumor espinal y para desarrollar estrategias inmunoterapéuticas para los gliomas de la médula espinal. Además, este método es muy adecuado para generar modelos de xenoinjertos derivados de pacientes para gliomas de médula espinal.

Este protocolo propone un procedimiento seguro, técnicamente sencillo y rápidamente reproducible para crear un modelo de trasplante de glioma de médula espinal en ratones. Se espera que el modelo avance en la investigación de los mecanismos en gran medida inexplorados que subyacen a la progresión del glioma y facilite el desarrollo de fármacos terapéuticos para los gliomas de la médula espinal.

Este protocolo se llevó a cabo cumpliendo con los lineamientos aprobados por el Comité Institucional para la Ética del Cuidado y Tratamiento Animal en la Investigación Biomédica de Capital Medical University (AEEI-2021-187). En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6, de 8 semanas de edad y con un peso de 19-21 g. Los reactivos y equipos utilizados se detallan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación prequirúrgica

1. Limpie y esterilice a fondo todos los instrumentos quirúrgicos.
2. Rocíe la mesa quirúrgica con alcohol y límpiela con toallas de papel estériles.

2. Preparación de células GL261-luc y B16-F10-luc para trasplante

NOTA: La línea celular GL261-luc GBM se obtuvo comercialmente, mientras que la línea celular de melanoma B16-F10-luc fue un regalo del profesor Wang Xi. Se confirmó que ambas líneas celulares estaban libres de infección por micoplasma mediante pruebas preexperimentales.

1. Prepare DMEM completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementándolo con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL).
2. Cultivo de células GL261-luc o B16-F10-luc en el medio DMEM completo y recolección de células durante la fase de crecimiento logarítmico para su implantación.
3. Lave las células dos veces con PBS estéril, luego incube con una solución de tripsina-EDTA al 0,05% durante 3 minutos.
4. Transfiera la suspensión celular resultante a un tubo y centrifugue a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células en PBS estéril y centrifugue una vez más.
6. Tiñe las células con azul de tripán y cuenta las células viables con un contador de células.
7. Prepare la suspensión celular a una concentración de 5 × 10⁶ células/ml para las células GL261-luc o de 5 × 10⁵ células/ml para las células B16-F10-luc, preparándola para su uso.

3. Preparación animal

1. Pesar y anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de una solución de tribromoetanol al 2,5% (10 μL/g). Confirme la anestesia comprobando si hay pérdida del reflejo pedal. Todo el procedimiento, desde la preparación hasta la sutura, debe durar aproximadamente de 5 a 10 minutos.
   NOTA: Coloque al animal sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante todo el procedimiento.
2. Exponga la piel y prepare una ventana quirúrgica limpia (Figura 1A). Afeitar el vello desde la región dorsal del cuello y un área de 2 cm que se extienda bilateralmente desde la línea media con una cortadora de pelo.
   1. Para eliminar los restos de vello, aplica una fina capa de crema depilatoria en las zonas afeitadas con un bastoncillo de algodón y déjala actuar durante 1-2 min. Después, limpia la crema depilatoria con una gasa humedecida con jabón.
3. Desinfectar la piel con una solución de yodo, aplicada con movimientos circulares durante 30 s, seguida de un paño con alcohol al 75% para la desyodación.

4. Exposición de la columna cervical y determinación del punto de inserción

1. Coloque los ratones con el lado dorsal hacia arriba y asegure sus extremidades a la mesa quirúrgica con cinta médica. Coloque una gasa de 1-2 cm de grosor debajo del área del cuello para apoyarse, proporcionando un mejor acceso a la médula espinal.
2. Realice una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la piel del cuello con un bisturí quirúrgico y una cuchilla (Figura 1B). Separe suavemente los músculos del cuello mediante una disección roma, teniendo cuidado de evitar lesionar los vasos sanguíneos.
3. Diseccionar cuidadosamente los músculos adyacentes a las vértebras cervicales para exponer la séptima apófisis vertebral espinosa cervical, un punto de referencia óseo distintivo en ratones (Figura 1C y Figura 1G-I).
4. Limpie la sangre del área quirúrgica con hisopos de algodón estériles antes de continuar con la inyección.
5. Fije el punto de punción a 0,5-0,9 mm de la línea media de la columna vertebral, ajustando la profundidad de inyección a 0,6-0,9 mm en función del peso corporal de los ratones (16-24 g).
   NOTA: La profundidad de inyección de la médula espinal es de 0,9 mm para ratones que pesan entre 22 y 24 g.

5. Inyección de células tumorales

1. Enjuague bien una jeringa de aguja plana de 10 μL con solución estéril de PBS 2-3 veces.
2. Extraiga 2 μL de la suspensión celular en la jeringa, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
3. Estabilice la apófisis espinosa vertebral cervical agarrándola suavemente y levantándola con pinzas. Utilice una aguja biselada (1,87 mm de longitud y 0,48 mm de diámetro) para perforar la duramadre (Figura 1D). A continuación, se cambia a una jeringa de aguja plana (0,48 mm de diámetro) para inyectar las células tumorales (Figura 1E).
   NOTA: El sitio de punción se conserva durante el cambio de aguja, con una ubicación precisa confirmada por los espasmos de las extremidades inferiores debido a la estimulación nerviosa.
4. Inyecte la suspensión celular lentamente para evitar interrupciones.
5. Mantenga la jeringa en su lugar durante 30 segundos después de la inyección para garantizar la implantación exitosa del tumor.

6. Cuidados postquirúrgicos

1. Cierre la incisión cutánea suturando con una sutura de nylon 3-0 al final de la operación (Figura 1F).
2. Coloque el ratón de lado y colóquelo sobre una alfombrilla térmica para mantener el calor y garantizar una respiración estable durante la recuperación de la anestesia en la jaula.
3. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea dos veces al día durante 3 días para aliviar el dolor.
4. Supervise el ratón para asegurarse de que recupera la actividad preoperatoria sin signos de sangrado o desgarro de la herida.
   NOTA: La disfunción temporal de la médula espinal, incluida la debilidad de las extremidades traseras, es común después de la cirugía y generalmente se resuelve en 3 horas. Aproximadamente el 5% de los ratones pueden desarrollar parálisis, pero generalmente se recuperan dentro de los 3 días. En el caso de estos ratones, proporcione una dieta nutricionalmente completa y agua en gel directamente en el suelo de la jaula para garantizar una accesibilidad adecuada. Un pequeño porcentaje (alrededor del 5%) de los ratones que experimentan paraplejia pueden requerir eutanasia.
5. Asegúrese de que los ratones tengan acceso continuo al agua y a la comida.
   NOTA: Si los animales muestran signos de pérdida de peso o parálisis, deben ser alojados individualmente.

7. Imágenes de bioluminiscencia in vivo

1. Administrar una inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de D-luciferina disuelta en D-PBS a los ratones.
2. Coloque a los ratones en una cámara de anestesia que contenga isoflurano para la inducción.
3. Transfiera los ratones al colector anestésico integral para mantener la anestesia durante el procedimiento.
4. Realizar imágenes bioluminiscentes in vivo como se describe en el informe anterior⁹.
   NOTA: El tiempo de respuesta óptimo para la D-luciferina en imágenes en vivo de animales pequeños es de 10 minutos después de la inyección. Asegúrese de que las imágenes se realicen con precisión 10 minutos después de la inyección.

Con el fin de establecer un modelo animal estable y confiable de glioma espinal, se identificó el espacio intervertebral entre la sexta y la séptima vértebras cervicales en ratones C57BL/6 como el sitio ideal para la inoculación con base en la revisión de la literatura y los hallazgos experimentales¹⁰. La séptima vértebra cervical proporciona un punto de referencia óseo distintivo, la apófisis espinosa (Figura 1G-I

El glioma de la médula espinal es el tipo más común de tumor maligno primario en la médula espinal y representa más del 80 % de los tumores intramedulares. Desde el punto de vista patológico, los gliomas de médula espinal se clasifican principalmente como ependimomas o astrocitomas, con especial atención a los astrocitomas¹¹. Entre los astrocitomas, algunos albergan mutaciones H3K27M, también conocidas como gliomas difusos de la línea media (DMG), que se...

No se declararon conflictos de interés.

Este trabajo fue apoyado por el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Fondo No. 8207317). Programa de Investigación y Desarrollo de la Comisión Municipal de Educación de Beijing (Fondo No. KZ202210025040). Institutos Chinos de Investigación Médica, Beijing (Subvención No. CX24PY08).