Trapianto chirurgico di cellule tumorali nel midollo spinale di topi

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello murino riproducibile di glioma del midollo spinale mediante l'iniezione di cellule tumorali nello spazio intervertebrale, offrendo un approccio più efficace e meno invasivo per la ricerca e lo sviluppo terapeutico.

I gliomi del midollo spinale sono comunemente tumori maligni del midollo spinale, che portano a un alto tasso di disabilità. Tuttavia, le linee guida uniformi per il trattamento e i dati completi sui gliomi del midollo spinale rimangono limitati a causa della mancanza di modelli animali preclinici adeguati. Lo sviluppo di un modello animale semplice e riproducibile è diventato essenziale per far progredire la ricerca di base e traslazionale. Un modello murino è l'ideale, poiché il midollo spinale murino condivide somiglianze strutturali con il midollo spinale umano. Questo protocollo descrive la generazione di un modello murino riproducibile di glioma del midollo spinale iniettando direttamente cellule tumorali nello spazio intervertebrale utilizzando il processo spinoso della settima vertebra cervicale come guida. Rispetto ad altri metodi, questo approccio è più efficace e conveniente, prevedendo un'incisione più piccola, una riduzione dell'invasività e della perdita di sangue, un recupero più rapido e una formazione del tumore più stabile. Si prevede che questo modello farà progredire la comprensione dei meccanismi della malattia, ottimizzerà le strategie chirurgiche e supporterà lo sviluppo di farmaci terapeutici per i gliomi del midollo spinale.

I gliomi del midollo spinale, compresi quelli della cauda equina, sono comunemente neoplasie maligne del midollo spinale, con il 20%-40% classificato come astrocitomi e il resto come ependimomi¹. Sulla base delle caratteristiche istologiche, i gliomi del midollo spinale sono classificati in quattro gradi (I-IV). I tumori di grado I e II sono considerati gliomi di basso grado, mentre i tumori di grado III e IV sono classificati come gliomi di alto grado. Sebbene i gliomi del midollo spinale possano verificarsi in qualsiasi segmento del midollo spinale, si trovano più frequentemente nella regione cervicale (33% dei casi) e sono relativamente rari in altre regioni, con il 26% dei casi nella regione toracica e il 24% nella regione lombare².

La chirurgia, la radioterapia e gli agenti alchilanti sono le principali opzioni di trattamento per i gliomi del midollo spinale, in gran parte estrapolate da studi clinici sui gliomi cerebrali³. Tuttavia, ricerche precedenti hanno dimostrato che, sebbene i profili istologici dei gliomi del midollo spinale assomiglino a quelli dei gliomi cerebrali, la presenza di firme molecolari distinte li differenzia dalle loro controparti cerebrali⁴. Nella nostra coorte, i pazienti con glioma del midollo spinale non hanno tratto alcun beneficio significativo né dalla chemioterapia adiuvante né dalla radioterapia, sottolineando la limitata efficacia dei trattamenti attuali e la necessità di nuove strategie terapeutiche⁵. Pertanto, modelli animali affidabili e informativi sono essenziali per far progredire la ricerca di base e gli studi preclinici.

Attualmente, esistono diversi modelli di glioma del midollo spinale ben consolidati, incluso il metodo descritto da Minru et ^al.6. Questi modelli utilizzano principalmente tecniche di rimozione delle vertebre toraciche per esporre il midollo spinale ^6,7,8. Sebbene i modelli di ratto siano stati impiegati in passato, sono associati a costi più elevati, dimensioni del campione più piccole e maggiori sfide di gestione rispetto ai modelli murini. Inoltre, sono disponibili più modelli murini sperimentali geneticamente modificati rispetto ai modelli di ratto. Un modello murino immunocompetente è particolarmente prezioso per studiare la risposta immunitaria all'interno del microambiente tumorale spinale e per sviluppare strategie immunoterapeutiche per i gliomi del midollo spinale. Inoltre, questo metodo è adatto per generare modelli di xenotrapianto derivati da pazienti per gliomi del midollo spinale.

Questo protocollo propone una procedura sicura, tecnicamente semplice e rapidamente riproducibile per la creazione di un modello di trapianto di glioma del midollo spinale nei topi. Si prevede che il modello farà avanzare la ricerca sui meccanismi in gran parte inesplorati alla base della progressione del glioma e faciliterà lo sviluppo di farmaci terapeutici per i gliomi del midollo spinale.

Questo protocollo è stato condotto in conformità con le linee guida approvate dal Comitato Istituzionale per l'Etica della Cura e del Trattamento degli Animali nella Ricerca Biomedica della Capital Medical University (AEEI-2021-187). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6, di età pari o superiore a 8 settimane e del peso di 19-21 g. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono descritti in dettaglio nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione pre-chirurgica

1. Pulire e sterilizzare accuratamente tutti gli strumenti chirurgici.
2. Spruzzare il tavolo operatorio con alcool e pulirlo con salviette di carta sterile.

2. Preparazione di cellule GL261-luc e B16-F10-luc per il trapianto

NOTA: La linea cellulare GL261-luc GBM è stata ottenuta commercialmente, mentre la linea cellulare di melanoma B16-F10-luc è stata un dono del professor Wang Xi. Entrambe le linee cellulari sono state confermate esenti da infezione da micoplasma attraverso test pre-sperimentali.

1. Preparare il DMEM completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium) integrandolo con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 μg/mL).
2. Coltura di cellule GL261-luc o B16-F10-luc nel terreno DMEM completo e raccolta delle cellule durante la fase di crescita logaritmica per l'impianto.
3. Lavare le cellule due volte con PBS sterile, quindi incubarle con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti.
4. Trasferire la sospensione cellulare risultante in una provetta e centrifugare a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule in PBS sterile e centrifugare nuovamente.
6. Colorare le cellule con il blu di tripano e contare le cellule vitali utilizzando un contacellule.
7. Preparare la sospensione cellulare a una concentrazione di 5 × 10⁶ cellule/mL per le cellule GL261-luc o 5 ×^{10 5} cellule/mL per le cellule B16-F10-luc, rendendola pronta per l'uso.

3. Preparazione degli animali

1. Pesare e anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di tribromoetanolo al 2,5% (10 μL/g). Confermare l'anestesia controllando la perdita del riflesso del pedale. L'intera procedura, dalla preparazione alla sutura, dovrebbe durare circa 5-10 minuti.
   NOTA: Posizionare l'animale su un termoforo per mantenere la temperatura corporea durante tutta la procedura.
2. Esporre la pelle e preparare una finestra chirurgica pulita (Figura 1A). Radere i peli dalla regione dorsale del collo e da un'area di 2 cm che si estende bilateralmente dalla linea mediana utilizzando un tagliacapelli.
   1. Per rimuovere i peli rimanenti, applicare uno strato sottile di crema depilatoria sulle zone rasate utilizzando un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per 1-2 minuti. Successivamente, rimuovere la crema depilatoria con una garza inumidita con sapone.
3. Disinfettare la pelle con una soluzione di iodio, applicata con movimenti circolari per 30 s, quindi strofinare con alcol al 75% per la deiodinazione.

4. Esposizione del rachide cervicale e determinazione del punto di inserzione

1. Posizionare i topi con il lato dorsale rivolto verso l'alto e fissare gli arti al tavolo chirurgico utilizzando del nastro adesivo. Posiziona una garza spessa 1-2 cm sotto la zona del collo per sostenerla, fornendo un migliore accesso al midollo spinale.
2. Praticare un'incisione longitudinale di circa 1,5 cm lungo la pelle del collo utilizzando un bisturi chirurgico e una lama (Figura 1B). Separare delicatamente i muscoli del collo mediante dissezione smussata, facendo attenzione a non ferire i vasi sanguigni.
3. Sezionare attentamente i muscoli adiacenti alle vertebre cervicali per esporre il settimo processo spinoso vertebrale cervicale, un punto di riferimento osseo distinto nei topi (Figura 1C e Figura 1G-I).
4. Eliminare il sangue dall'area chirurgica utilizzando tamponi di cotone sterili prima di procedere con l'iniezione.
5. Impostare il punto di puntura a 0,5-0,9 mm dalla linea mediana della colonna vertebrale, regolando la profondità di iniezione a 0,6-0,9 mm in base al peso corporeo dei topi (16-24 g).
   NOTA: La profondità di iniezione del midollo spinale è di 0,9 mm per topi di peso compreso tra 22 e 24 g.

5. Iniezione di cellule tumorali

1. Sciacquare accuratamente una siringa ad ago piatto da 10 μl con soluzione sterile di PBS 2-3 volte.
2. Aspirare 2 μl di sospensione cellulare nella siringa, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
3. Stabilizzare il processo spinoso vertebrale cervicale afferrandolo delicatamente e sollevandolo con una pinza. Utilizzare un ago smussato (1,87 mm di lunghezza e 0,48 mm di diametro) per forare la dura madre (Figura 1D). Quindi, passare a una siringa ad ago piatto (0,48 mm di diametro) per iniettare le cellule tumorali (Figura 1E).
   NOTA: Il sito di puntura viene preservato durante il cambio dell'ago, con un posizionamento accurato confermato dalle contrazioni degli arti inferiori dovute alla stimolazione nervosa.
4. Iniettare lentamente la sospensione cellulare per evitare interruzioni.
5. Tenere la siringa in posizione per 30 secondi dopo l'iniezione per garantire il successo dell'impianto del tumore.

6. Cure post-chirurgiche

1. Chiudere l'incisione cutanea suturandola con una sutura di nylon 3-0 al termine dell'operazione (Figura 1F).
2. Posiziona il mouse su un lato e posizionalo su un tappetino riscaldato per mantenere il calore e garantire una respirazione stabile durante il recupero dall'anestesia nella gabbia.
3. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea due volte al giorno per 3 giorni per alleviare il dolore.
4. Monitorare il mouse per assicurarsi che riacquisti l'attività preoperatoria senza segni di sanguinamento o lacerazione della ferita.
   NOTA: La disfunzione temporanea del midollo spinale, inclusa la debolezza degli arti posteriori, è comune dopo l'intervento chirurgico e in genere si risolve entro 3 ore. Circa il 5% dei topi può sviluppare una paralisi, ma di solito guarisce entro 3 giorni. Per questi topi, fornire una dieta nutrizionalmente completa e acqua gelificata direttamente sul pavimento della gabbia per garantire un'adeguata accessibilità. Una piccola percentuale (circa il 5%) di topi che soffrono di paraplegia può richiedere l'eutanasia.
5. Assicurati che i topi abbiano accesso continuo all'acqua e al cibo.
   NOTA: Se gli animali mostrano segni di perdita di peso o paralisi, devono essere alloggiati individualmente.

7. Imaging in bioluminescenza in vivo

1. Somministrare ai topi un'iniezione intraperitoneale di 150 mg/kg di D-luciferina disciolta in D-PBS.
2. Metti i topi in una camera di anestesia contenente isoflurano per l'induzione.
3. Trasferire i topi nel collettore anestetico integrale per mantenere l'anestesia durante la procedura.
4. Eseguire l'imaging bioluminescente in vivo come descritto nel rapporto precedente⁹.
   NOTA: Il tempo di risposta ottimale per la D-luciferina nell'imaging dal vivo di piccoli animali è di 10 minuti dopo l'iniezione. Assicurarsi che l'imaging venga eseguito esattamente 10 minuti dopo l'iniezione.

Per stabilire un modello animale stabile e affidabile di glioma spinale, lo spazio intervertebrale tra la sesta e la settima vertebra cervicale nei topi C57BL/6 è stato identificato come il sito ideale per l'inoculazione sulla base della revisione della letteratura e dei risultati sperimentali¹⁰. La settima vertebra cervicale fornisce un punto di riferimento osseo distinto, il processo spinoso (Figura 1G-I

Il glioma del midollo spinale è il tipo più comune di tumore maligno primario nel midollo spinale, rappresentando oltre l'80% dei tumori intramidollari. Dal punto di vista patologico, i gliomi del midollo spinale sono classificati principalmente come ependimomi o astrocitomi, con particolare attenzione agli astrocitomi¹¹. Tra gli astrocitomi, alcuni ospitano mutazioni H3K27M, note anche come gliomi diffusi della linea mediana (DMG), che sono associate a prognosi...

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Generale della National Natural Science Foundation of China (Fondo n. 8207317). Programma di ricerca e sviluppo della Commissione municipale per l'istruzione di Pechino (Fondo n. KZ202210025040). Istituti cinesi per la ricerca medica, Pechino (sovvenzione n. CX24PY08).