TO e TD sono stati supportati rispettivamente dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999.

1. Mantenimento delle colonie di laboratorio
<ol><li>Per il mantenimento di popolazioni di wildtype e mutanti, utilizzare un grande contenitore di plastica (460 mm x 360 mm x 170 mm) con cibo di pesce artificiale regolare, acqua in tazze di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2A). Mantenere tutte le colture T. domestica all'interno di incubatori a 37 °C e impostare l'umidità relativa (RH) all'interno di ciascun contenitore sul 60%-80%. NOTA: Poiché T. domestica assorbe il vapore acqueo dall'atmosfera11, non è necessario un approvvigionamento idrico diretto. L'rh appropriato viene mantenuto a causa della presenza di vapore acqueo da tazze di plastica contenenti un foro di ventilazione sulla parte superiore o da tazze senza coperchio all'interno di ogni contenitore. Non è necessario umidificare all'interno di un intero incubatore che contiene colture. La durata approssimativa di ogni fase di sviluppo alle condizioni descritte nel presente protocollo è illustrata nella figura 1. La velocità di sviluppo potrebbe essere regolata modificando la temperatura e/o RH12.</li>
	<li>Aggiungere periodicamente del cibo. Aggiungere acqua prima che si aserti.</li>
	<li>Trasferire le popolazioni in un nuovo contenitore pulito almeno ogni 3 mesi, dato che gli adulti smettono di deporre le uova in un ambiente sporco e/o in una popolazione densa (cfr. discussione).</li>
</ol>2. Raccolta delle uova e microiniezione
<ol><li>Progettare un RNA guida (gRNA)<ol>
<li>Progettare una sequenza di gRNA per ogni bersaglio richiesto e FAR ESPLODERE le sequenze di gRNA rispetto all'assemblaggio del genoma per controllare possibili siti di riconoscimento fuori bersaglio.</li>
		<li>Sintetizzare e purificare i gRNA secondo le istruzioni del produttore8. NOTA: Ad esempio, nel caso del gene bianco del trasportatore di cassette legante ATP, è stata progettata una sequenza target di 20 bp e sono stati ordinati due oligonucleotidi del DNA sintetizzati 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Il modello di DNA è stato preparato ricotturando questi due oligonucleotidi seguiti dall'amplificazione PCR e il gRNA viene quindi trascritto in vitro dal modello con una T7 RNA polimerasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare colonie di raccolta delle uova<ol>
<li>Trasferire circa 20 adulti maschi e 20 femmine in un contenitore di medie dimensioni (200 mm x 150 mm x 90 mm) con cibo, approvvigionamento idrico, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2B).</li>
		<li>Creare diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni messi in scena in un breve periodo di tempo da utilizzare per l'editing del genoma. NOTA: Si prevede che circa 20-40 uova saranno raccolte da una colonia dopo 8 ore a 37 °C. Di solito ci vogliono alcuni giorni perché gli adulti trasferiti inizino a deporre le uova, probabilmente a causa dell'adattamento a un nuovo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, sostituire il cotone all'interno dei contenitori con quelli nuovi.</li>
	<li>Posizionare un nastro 76 mm x 5 mm su un normale scivolo di vetro da 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati usando le forcep.</li>
	<li>Allineare le uova sul nastro a doppia parte utilizzando un pennello bagnato e mantenere una distanza di 2 mm tra le uova. Tutte le uova devono essere orientate in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia fronte al lato dell'iniezione(figura 3A). Premere delicatamente le uova con un pennello per una tenuta ferma durante l'iniezione. NOTA: In questo protocollo, il fungo cresce velocemente nelle uova iniettate danneggiate in condizioni umide e calde. È importante mantenere la distanza tra le uova per prevenire la contaminazione incrociata e l'espansione del fungo.</li>
	<li>Mescolare la proteina gRNA e Cas9 con una concentrazione finale rispettivamente di 100 ng/μL e 500 ng/μL. Utilizzare acqua distillata per la diluizione. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente per promuovere la formazione complessa di ribonucleoproteina e quindi mantenere il mix sul ghiaccio. NOTA: Il rosso neutro a una concentrazione finale dell'1% potrebbe essere aggiunto alla soluzione di iniezione per monitorare la quantità iniettata.</li>
	<li>Caricare 2 μL della soluzione gRNA/Cas9 in un capillare di iniezione di vetro con un microloader. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, toccare l'ago per rimuovere le bolle. NOTA: In questo esperimento viene utilizzato un ago già pronto per ottenere una punta dell'ago fine (Figura 3B). Un ago fatto in casa con una forma simile potrebbe invece essere usato.</li>
	<li>Fissare il capillare di iniezione di vetro, precedentemente caricato con la soluzione gRNA/Cas9, a un supporto dotato di manipolatore e collegare il supporto a un microiniettore elettronico.</li>
	<li>Ottimizzare la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con pini per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni (un esempio di ago appropriato è mostrato nella figura 3C). NOTA: Si consiglia di cambiare un ago quando è intasato. È possibile continuare a iniettare con lo stesso ago se viene rotto di nuovo con pini, ma una punta più ampia porta a più danni alle uova e abbassa il loro tasso di sopravvivenza. Poiché le uova T. domestica sono morbide e fragili, mantenere una punta dell'ago fine è la chiave per avere un alto tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione.</li>
	<li>Inserire l'ago nel punto centrale dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una leggera quantità della soluzione (vedere figura 3D-H per riferimento sulla quantità di iniezione). Regolare la configurazione del microiniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago. NOTA: Si consiglia di applicare una pressione costante durante l'iniezione, altrimenti il contenuto di uova appiccicoso può facilmente fluire nell'ago di vetro e può ostruirlo. La soluzione può essere iniettare un impulso di pressione breve o con una pressione costante, a seconda della quantità di liquido iniettato. Tenere presente che quando una punta dell'ago ha un'ampia apertura, inietta troppa soluzione in un uovo, il che causa letalità (Figura 3F-H). In tal caso, mantenere un flusso liquido costante a pressione costante, quindi inserire l'ago in un uovo ed estrarlo immediatamente. Se provoca troppo overflow o l'uovo esplode, cambiare l'ago.</li>
	<li>Conservare le uova iniettate in un contenitore con le dimensioni appropriate per il numero di uova iniettate (<20 uova: piccolo piatto; >20 uova: contenitore di medie dimensioni) con 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Accoppiamento
<ol><li>Controllare periodicamente le uova iniettate e scartare le uova danneggiate con forcep per evitare la crescita fungina(Figura 3I,J). Nel caso in cui troppo fungo cresce su un uovo, pulire la superficie dell'uovo con il 70% di EtOH.</li>
	<li>Prima della schiusa (circa 10 giorni a 37 °C dopo la deposizione delle uova), immergere lo scivolo di vetro con le uova iniettate in polvere di talco per rivestire la superficie del nastro a doppia mano. Ciò eviterà l'impilamento di ninfe tratteggiate. Trasferisci i vetri rivestiti di polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e una carta piegata per nascondere gli insetti.</li>
	<li>Rimuovere gli scivoli di vetro dopo che le ninfe si sono schiuse. Fornire periodicamente cibo fino a raggiungere l'età adulta. NOTA: Ci vogliono circa 2,0-2,5 mesi perché gli individui raggiungano l'età adulta dopo la schiusa (Figura 1A). Lo stadio adulto è giudicato sulla base di un ovopositore ben sviluppato nelle femmine (Figura 1B).</li>
	<li>Per accoppiare gli individui, trasferire tutte le adulti femmine di tipo selvatico necessarie da una colonia di laboratorio al contenitore di medie dimensioni e incubarle per almeno 14 giorni a 37 °C per assicurarsi che siano vergini. NOTA: Non è necessario raccogliere femmine vergini da una colonia di laboratorio perché l'adulto T. domestica ha un ciclo ripetuto di muta e accoppiamento chiamato "ciclo riproduttivo e muta", durante il quale le femmine gettano via lo sperma con ogni muta e si accoppiano di nuovo nel prossimo ciclo di fecondazione13.</li>
	<li>Trasferire un maschio o una femmina G0 adulto che si è sviluppato da un uovo iniettato e adulto di tipo selvatico a un piccolo piatto di plastica (Ø 100 mm x 40 mm) con cibo, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone per la deposizione delle uova G1(Figura 2C'; piatto di accoppiamento). Conservare i piatti di accoppiamento in un contenitore più grande con 60%-80% RH (Figura 2C). NOTA: Più adulti di tipo selvatico possono essere inclusi in un piatto per aumentare le possibilità di accoppiamento di successo, anche se sono stati raggiunti alti tassi di successo con l'accoppiamento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipizzazione
<ol><li>Progetta coppie di primer PCR per ogni gRNA per amplificare un prodotto da 100 a 200 bp che include il sito preso di mira dal gRNA. BLAST ogni sequenza di primer rispetto all'assemblaggio del genoma per verificarne la specificità (un esempio è mostrato per il targeting del gene bianco nella figura 4A).</li>
	<li>Controlla la trasformazione germinale degli adulti G0.<ol>
<li>Cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere singole uova G1 da ogni coppia adulta G0 in tubi da 0,2 ml (un uovo per tubo; conservare campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). Separare gli strati di cotone per raccogliere le uova. NOTA: Si consiglia di genotipare almeno 12 ninfe G1 da ogni coppia di accoppiamenti per valutare il successo della trasmissione della linea germinale (vedi Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Aggiungere 15 μL di una soluzione di Proteinasi K da 0,25 mg/mL (sciolta nel tampone Tris-EDTA) a ciascun tubo, omogeneizzare brevemente i campioni con stuzzicadenti e incubare a 55 °C per 3-16 ore.</li>
		<li>Inattivare la Proteinasi K posizionando i campioni a 95 °C per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di acqua distillata ad ogni tubo e mescolare bene. Utilizzare 2 μL di supernatante in una miscela di reazione PCR da 10 μL contenente i primer progettati nella fase 4.1. NOTA: Si consiglia l'uso di una DNA polimerasi ottimizzata per i modelli grezzi per raggiungere un'amplificazione PCR sufficiente.</li>
		<li>Per analizzare i prodotti PCR, eseguire un saggio di mobilità eteroduplex (HMA) con un sistema di elettroforesi a microchip(Figura 3B;vedi Ohde et al., 2018)8. NOTA: Le mutazioni potrebbero essere valutate con due metodi alternativi: (1) HMA con polimeri gel standard, come l'8% di poliacrilammide14; (2) digestione di prodotti PCR con endonucleasi T7 seguita da elettroforesi del gel di agarosio15.</li>
		<li>Conservare solo le ninfe G1 risultanti da adulti G0 che contengono mutazioni nella loro linea germinale e scartare le altre.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipizzazione individuale di ninfe/adulti G1<ol>
<li>Isolare le ninfe G1 in piastre da 24 po 'con un aspiratore o un pennello. Posizionare le piastre a 24 pomp poggiamenti in un contenitore più grande (ad esempio, il contenitore di medie dimensioni utilizzato in questo protocollo) con l'approvvigionamento idrico come descritto sopra per mantenere un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantenere l'approvvigionamento di alimenti artificiali regolari a base dipesce (figura 1D'). NOTA: Sebbene questo passaggio possa essere eseguito in qualsiasi punto delle fasi ninfee e adulte, si consiglia di eseguito dopo aver raggiunto l'età adulta e poco prima dell'accoppiamento (>2,5 mesi dopo l'iniezione; Figura 1B) perché è più facile mantenere i vigili del fuoco in un grande contenitore. L'allevamento individuale è necessario per tracciare il genotipo di ogni ninfa G1 nei seguenti passaggi. Le ninfe G1 dello stesso adulto G0 possono avere mutazioni diverse.</li>
		<li>Pizzicare e estrarre i cerci e il filamento caudale da una ninfa/adulto usando le flesse e raccoglierli in un tubo da 0,2 ml contenente 50 μL EtOH (conservare i campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). NOTA: I campioni di tessuto vengono raccolti in EtOH perché prevengono la perdita di questi piccoli campioni a causa dell'elettricità statica. Se è necessario fermare il movimento degli insetti, anestetizzare la ninfa / adulto sul ghiaccio quando si preleva campioni di tessuto. Poiché T. domestica non può sopravvivere dopo il raffreddamento a lungo termine sul ghiaccio, non anestetizzarli per più di un minuto e spostarli immediatamente a temperatura ambiente. L'ablazione dei cerci e del filamento caudale non causa alcun aumento della mortalità.</li>
		<li>Posizionare i tubi campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 °C per evaporare l'EtOH.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 4.2.2 a 4.2.5 per genotipizzazione.</li>
		<li>Inviare i prodotti PCR in cui si osserva un modello di banda mutante a un servizio di sequenziamento Sanger standard.</li>
		<li>Mantenere le ninfe/adulti G1 con le mutazioni desiderate e scartare le altre (vedere la figura 4C per un risultato di sequenziamento rappresentativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Attraversa gli adulti contenenti le mutazioni desiderate in un piatto di accoppiamento e ottieni le generazioni successive per stabilire un ceppo mutante omozigoto.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l'iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta<...

Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animaledescritta 1. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamente breve (2,5-3,0 mesi dall'embrione all'adulto riproduttivo; Figura 1A) e un allevamento facile. Negli ultimi tre decenni, il suo uso è stato ampliato per indagare le caratteristiche ancestrali di vari tratti come la pianta corporea, la differenziazione neurale e i ritmicircadiani 2,3,4.
L'applicazione di strumenti genetici avanzati in T. domestica potrebbe accelerare ulteriormente tali contributi in un'ampia area di ricerca. Il successo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) mediato dal gene in embrioni, ninfe e adulti è stato riportato in T. domestica4,5,6. L'efficienza della RNAi sistemica è ancora altamente dipendente dalle specie, ad esempio è generalmente elevata nei coleotteri mentre è bassa nell'ordine dei lepidotteri7. L'efficienza e la durata del knockdown RNAi in T. domestica devono ancora essere valutate. Oltre a RNAi, abbiamo precedentemente segnalato un knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 di successo in T. domestica8. Il sistema CRISPR/Cas è stato ampiamente applicato per l'editing del genoma negli insetti, in particolare per il knockout genico mirato. Il suo uso potrebbe essere ampliato per altre applicazioni come il test gene reporter, il tracciamento del lignaggio cellulare e la manipolazione dell'attività trascrizionale bussando a costrutti esogeni dopo l'istituzione di un protocollo per la consegna di componenti del sistema CRISPR / Cas nei nuclei9. In combinazione con l'assemblaggio del genomapubblicato 10, l'ampio utilizzo e l'ulteriore sviluppo dell'editing del genoma basato su CRISPR /Cas in T. domestica faciliterebbero gli studi incentrati sui meccanismi evolutivi alla base dell'eccezionale successo adattivo degli insetti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la microiniezione embrionale e per l'accoppiamento di T. domestica adulto per generare un ceppo mutante utilizzando CRISPR / Cas9. Considerando questo nuovo metodo, discutiamo l'importanza di considerare la biologia unica delle specie modello non tradizionali per applicazioni di successo di queste tecniche.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L'applicazione di strumenti genetici come l'editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l'importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell'applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell'implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l'applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.

Nelle nostre mani, circa 100 uova possono essere ben iniettate con un singolo capillare di iniezione quando ha la punta adeguata(Figura 3C). L'iniezione di gRNA/Cas9 complesso di ribonucleoproteina negli embrioni entro le prime 8 ore dopo la deposizione delle uova provoca indeli nel sito mirato al gRNA. Ciò causa mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata (G0) e quindi i fenotipi di mosaico mutante sono solitamente ottenuti in G0. Ad esempio, quando questo protocoll...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Views.  Kyoto University. Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Genetica

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Biologia dello sviluppo

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamento

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioingegneria

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biologia

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...