TO e TD foram apoiados pelos números de subvenção JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999, respectivamente.

1. Manutenção de colônias de laboratório
<ol><li>Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%. NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera11,um fornecimento direto de água não é necessário. O RH apropriado é mantido devido à presença de vapor de água de copos plásticos contendo um orifício de ventilação na parte superior ou de copos sem tampa dentro de cada recipiente. Não há necessidade de umidificar dentro de uma incubadora inteira que contém culturas. A duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento sob a condição descrita neste protocolo é mostrada na Figura 1. A velocidade de desenvolvimento poderia ser ajustada alterando a temperatura e/ou RH12.</li>
	<li>Adicione comida periodicamente. Adicione água antes que se doe.</li>
	<li>Transfira as populações para um novo recipiente limpo pelo menos a cada 3 meses, dado que os adultos param de colocar ovos em um ambiente sujo e/ou população densa (ver Discussão).</li>
</ol>2. Coleta de ovos e microinjeção
<ol><li>Projete um RNA guia (gRNA)<ol>
<li>Projete uma sequência de gRNA para cada alvo necessário e BLAST as sequências de gRNA contra o conjunto do genoma para verificar possíveis locais de reconhecimento fora do alvo.</li>
		<li>Sintetizar e purificar as gRNAs de acordo com as instruções do fabricante8. NOTA: Como exemplo, no caso de direcionar o gene branco do transportador de de ligação ATP, foi projetada uma sequência de alvos de 20 bps e dois oligonucleotídeos de DNA sintetizados 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCACACACACACACTTA-3' foram ordenados. O modelo de DNA foi preparado por annealing esses dois oligonucleotídeos seguidos de amplificação PCR e o gRNA é então in vitro transcrito do modelo com uma polimerase T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare colônias de coleta de ovos<ol>
<li>Transfira cerca de 20 adultos do sexo masculino e 20 do sexo feminino para um recipiente de tamanho médio (200 mm x 150 mm x 90 mm) com alimentos, abastecimento de água, papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para a colocação de ovos(Figura 2B).</li>
		<li>Configure várias colônias para obter um grande número de embriões encenados em um curto período de tempo para serem usados para a edição de genomas. NOTA: Cerca de 20 a 40 ovos devem ser coletados de uma colônia após 8h a 37 °C. Geralmente leva alguns dias para os adultos transferidos começarem a colocar ovos, possivelmente devido à adaptação a um novo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por novos.</li>
	<li>Coloque uma fita de 76 mm x 5 mm de dupla face em uma lâmina de vidro normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Oito horas depois, recolhe os ovos do algodão em camadas separando as camadas usando fórceps.</li>
	<li>Alinhe os ovos na fita de dois lados usando um pincel de tinta molhada e mantenha uma distância de 2 mm entre os ovos. Todos os ovos devem ser orientados para que o eixo longitudinal de um ovo enfrente o lado da injeção(Figura 3A). Pressione suavemente os ovos com uma escova de tinta para segurar firme durante a injeção. NOTA: Neste protocolo, o fungo cresce rapidamente em ovos injetados danificados em condições molhadas e quentes. É importante manter a distância entre os ovos para evitar contaminação cruzada e expansão de fungos.</li>
	<li>Misture a proteína gRNA e Cas9 a uma concentração final de 100 ng/μL e 500 ng/μL, respectivamente. Use água destilada para diluição. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente para promover a formação complexa da ribonucleoproteína e, em seguida, manter a mistura no gelo. NOTA: O vermelho neutro a uma concentração final de 1% pode ser adicionado à solução de injeção para monitorar a quantidade injetada.</li>
	<li>Carregue 2 μL da solução gRNA/Cas9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador. Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, toque na agulha para remover as bolhas. NOTA: Neste experimento, uma agulha pronta é usada para obter uma ponta fina de agulha(Figura 3B). Uma agulha caseira com uma forma semelhante poderia ser usada em vez disso.</li>
	<li>Fixar o capilar de injeção de vidro, previamente carregado com a solução gRNA/Cas9, a um suporte equipado com um manipulador e conectar o suporte a um microinjetor eletrônico.</li>
	<li>Otimize a forma da ponta da agulha, quebrando-a ligeiramente com fórceps para evitar entupimento e melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções (um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 3C). NOTA: Recomenda-se trocar uma agulha quando estiver entupida. É possível continuar injetando com a mesma agulha se for quebrada novamente com fórceps, mas uma ponta mais larga leva a mais danos aos ovos e reduz sua taxa de sobrevivência. Como os ovos T. domestica são macios e frágeis, manter uma ponta fina de agulha é fundamental para ter uma alta taxa de sobrevivência após a injeção.</li>
	<li>Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução (ver Figura 3D-H para referência sobre a quantidade de injeção). Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo da forma da ponta da agulha. NOTA: Recomenda-se aplicar uma pressão constante durante a injeção, caso contrário, o conteúdo de ovos pegajoso pode facilmente fluir para dentro da agulha de vidro e pode entupi-lo. A solução pode ser injetar com um pulso de pressão curta ou com uma pressão constante, dependendo da quantidade de líquido injetado. Tenha em mente que quando uma ponta de agulha tem uma abertura larga, muita solução é injetada em um ovo, o que causa letalidade(Figura 3F-H). Nesse caso, mantenha um fluxo líquido constante por pressão constante, em seguida, insira a agulha em um ovo e puxe-a imediatamente. Se causar muito transbordamento ou o ovo estourar, troque a agulha.</li>
	<li>Mantenha os ovos injetados em um recipiente com o tamanho adequado para o número de ovos injetados (<20 ovos: prato pequeno; >20 ovos: recipiente de tamanho médio) com 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Acasalamento
<ol><li>Verifique periodicamente os ovos injetados e descarte ovos danificados com fórceps para evitar o crescimento fúngico(Figura 3I,J). No caso de muito fungo está crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclodir (aproximadamente 10 dias a 37 °C após a colocação do ovo), mergulhe o deslizamento de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita de dois lados. Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira os slides de vidro revestidos em pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado para esconder os insetos.</li>
	<li>Remova as lâminas de vidro depois que as ninfas chocarem. Forneça periodicamente alimentos até chegarem à idade adulta. NOTA: Leva cerca de 2,0-2,5 meses para os indivíduos chegarem à idade adulta após a eclosão(Figura 1A). A fase adulta é julgada com base em um ovipositor bem desenvolvido em fêmeas(Figura 1B).</li>
	<li>Para acasalar os indivíduos, transfira quantos adultos fêmeas precisam de uma colônia de laboratório para o recipiente de tamanho médio e incuba-os por pelo menos 14 dias a 37 °C para ter certeza de que são virgens. NOTA: Não é necessário coletar fêmeas virgens de uma colônia de laboratório porque a T. domestica adulta tem um ciclo repetido de molting e acasalamento chamado "ciclo reprodutivo e de fusão", durante o qual as fêmeas jogam fora esperma com cada molt e mate novamente no próximo ciclo de fertilização13.</li>
	<li>Transfira um macho ou uma fêmea G0 adulto que se desenvolveu de um ovo injetado e um adulto wildtype(s) para um pequeno prato plástico (Ø 100 mm x 40 mm) com alimentos, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão para a colocação de ovos G1(Figura 2C'; prato de acasalamento). Mantenha os pratos de acasalamento em um recipiente maior com 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Vários adultos selvagens podem ser incluídos em um prato para aumentar a chance de acasalamento bem sucedido, embora altas taxas de sucesso tenham sido alcançadas com um par.</li>
</ol>4. Genotipagem
<ol><li>Design pcr primer pares para cada gRNA para amplificar um produto de 100-200 bp que inclui o site visado pelo gRNA. BLAST cada sequência de primer contra o conjunto do genoma para verificar sua especificidade (um exemplo é mostrado para o direcionamento do gene branco na Figura 4A).</li>
	<li>Verifique a transformação germinal dos adultos G0.<ol>
<li>Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos. NOTA: Recomenda-se genótipo pelo menos 12 ninfas G1 de cada par de acasalamento para avaliar o sucesso da transmissão germinal (ver Resultados Representativos).</li>
		<li>Adicione 15 μL de uma solução Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissolvida em tampão Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneize brevemente amostras com palitos de dente e incubar a 55 °C por 3 a 16 h.</li>
		<li>Inative o Proteinase K colocando as amostras a 95 °C por 10 minutos.</li>
		<li>Adicione 90 μL de água destilada em cada tubo e misture bem. Use 2 μL de supernasário em uma mistura de reação PCR de 10 μL contendo os primers projetados na etapa 4.1. NOTA: Recomenda-se o uso de uma polimerase de DNA otimizada para modelos brutos para atingir amplificação pcr suficiente.</li>
		<li>Para analisar os produtos PCR, realize um ensaio de mobilidade heteroduplex (HMA) com um sistema de eletroforese de microchip(Figura 3B; ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: As mutações podem ser avaliadas com dois métodos alternativos: (1) HMA com polímeros de gel padrão, como 8% poliacrilamida14; (2) digestão de produtos PCR com endonuclease T7 seguida de eletroforese de gel agarose15.</li>
		<li>Mantenha apenas as ninfas G1 resultantes de adultos G0 que contêm mutações em sua germe e descarte as outras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipagem individual de ninfas/adultos do G1<ol>
<li>Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D).. NOTA: Embora esta etapa possa ser realizada em qualquer ponto de estágios ninfais e adultos, recomenda-se realizá-la após atingir a idade adulta e pouco antes do emparelhamento (>2,5 meses após a injeção; Figura 1B) porque é mais fácil manter os focos de incêndio em um recipiente grande. A criação individual é necessária para rastrear o genótipo de cada ninfa G1 nas etapas a seguir. Ninfas G1 do mesmo G0 adulto podem ter mutações diferentes.</li>
		<li>Aperte e puxe cerci e o filamento caudal de uma ninfa/adulto usando fórceps e colete-os em um tubo de 0,2 mL contendo 50 μL EtOH (armazene as amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). NOTA: As amostras de tecido são coletadas em EtOH porque evita a perda dessas pequenas amostras devido à eletricidade estática. Se for preciso parar o movimento dos insetos, anestesia a ninfa/adulto no gelo ao colher amostras de tecido. Como T. domestica não pode sobreviver após o resfriamento a longo prazo no gelo, não anestesia-os por mais de um minuto e imediatamente movê-los de volta à temperatura ambiente. A ablação do cerci e do filamento caudal não causa aumento da mortalidade.</li>
		<li>Coloque tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 °C para evaporar o EtOH.</li>
		<li>Repetir passos 4.2.2-4.2.5 para genotipagem.</li>
		<li>Envie os produtos PCR nos quais um padrão de banda mutante é observado para um serviço padrão de sequenciamento Sanger.</li>
		<li>Mantenha as ninfas/adultos do G1 com as mutações desejadas e descarte as outras (ver Figura 4C para um resultado de sequenciamento representativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruze os adultos contendo as mutações desejadas em um prato de acasalamento e obtenha as próximas gerações para estabelecer uma cepa mutante homozigosa.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada moltadulto 13....

A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas1. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto reprodutivo; Figura 1A) e uma criação fácil. Nas últimas três décadas, seu uso foi expandido para investigar características ancestrais de vários traços, como plano corporal, diferenciação neural e ritmos circadianos2,3,4.
A aplicação de ferramentas genéticas avançadas em T. domestica poderia acelerar ainda mais tais contribuições em uma ampla área de pesquisa. A interferência de RNA bem sucedida (RNAi) mediada por danos genéticos em embriões, ninfas e adultos foi relatada em T. domestica4,5,6. A eficiência do RNAi sistêmico ainda é altamente dependente de espécies — por exemplo, é geralmente alta em coleoptera, enquanto é baixa na ordem lepidoptera7. A eficiência e duração do knockdown rnai em T. domestica ainda está para ser avaliada. Além da RNAi, já reportamos um nocaute genético bem sucedido no CRISPR/Cas9 mediado em T. domestica8. O sistema CRISPR/Cas tem sido amplamente aplicado para edição de genomas em insetos particularmente para nocaute genético direcionado. Seu uso poderia ser expandido para outras aplicações, como ensaio de repórteres genéticos, rastreamento de linhagem celular e manipulação da atividade transcricional, derrubando construções exógenas após o estabelecimento de um protocolo para a entrega de componentes do sistema CRISPR/Cas em núcleos9. Combinado com o conjunto de genomas publicado10,o amplo uso e o desenvolvimento da edição de genoma baseada em CRISPR/Cas em T. domestica facilitaria estudos com foco nos mecanismos evolutivos por trás do excelente sucesso adaptativo dos insetos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para microinjeção de embriões e para acasalamento adulto T. domestica para gerar uma cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Considerando este novo método, discutimos a importância de considerar a biologia única de espécies modelos não tradicionais para aplicações bem sucedidas dessas técnicas.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.

Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para inje...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K visualizações.  Kyoto University. Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Vídeo: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Biologia do Desenvolvimento

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamento

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioengenharia

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biologia

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...