Questa tecnica funge da metodo fondamentale per esperimenti progettati per saggiare lo sviluppo embrionale o larvale del cricket. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è flessibile e supporterà diversi tipi di approcci sperimentali, come quelli che utilizzano interferenze di RNA o manipolazione genomica. A dimostrare la procedura sarà Hadley Wilson Horch, l'investigatore principale del laboratorio.
Per iniziare questa procedura bagnare il piano di smerigliatrice rotante della smussatura con acqua gocciolante. Posizionare l'ago tirato nella smussatura e trasformarlo in un angolo di 20 gradi. Abbassare l'ago fino a toccarlo e smussarlo per due o tre minuti.
Valutare la smussatura posizionando l'ago smussato su nastro a doppio bastoncino che è stato aderito a uno scivolo al microscopio in vetro. Posizionare la diapositiva sul palco di un microscopio composto dotato di una fotocamera e di un software di acquisizione di immagini. Acquisire un'immagine dell'ago utilizzando un obiettivo 20x.
Utilizzare il software di imaging per misurare il diametro interno del lume dell'ago appena prossimo all'apertura smussata. Scartare gli aghi con un'apertura inferiore a otto micrometri o superiore a 12 micrometri. In primo luogo, fare 40 millilitri di 1%agarosio in acqua e versarlo in una piastra di Petri di 10 centimetri.
Posizionare un uovo ben stampato sulla superficie dell'agarosio prima che si solidifichi. Una volta solidificato l'agarosio, rimuovere il timbro per rivelare i pozzi. Quindi, riempire la piastra del pozzo di agarosio con HBS contenente 1%di streptomicina penicillina.
Posizionare il coperchio sul piatto, avvolgerlo in Parafilm e conservarlo a quattro gradi Celsius. Dopo questo, riempi una piastra di Petri di 35 millimetri con sabbia bianca del parco giochi per preparare un piatto di raccolta delle uova per i grilli in cui deporre le uova. Coprire il piatto d'uovo con un tovagliolo di carta tagliato a circa 18 per 18 centimetri.
Riempire con acqua del rubinetto attraverso l'asciugamano di carta. Quindi, inclinare la piastra di Petri e spremere delicatamente la parte superiore per rimuovere l'acqua in eccesso. Infilare gli angoli del quadrato dell'asciugamano di carta sotto il piatto e posizionare il piatto d'uovo in un coperchio rovesciato che aiuterà a mantenere l'asciugamano di carta in posizione.
Metti il piatto d'uovo nel cestino del cricket e consenti alle femmine adulte di ovoposit le uova per una o due ore. Nel frattempo, lasciare riscaldare il piatto di agarosio a temperatura ambiente in preparazione per tenere le uova iniettate. Quando sei pronto, rimuovi il piatto di raccolta delle uova, ora contenente uova appena deposte, dal cestino del cricket.
Rimuovere il tovagliolo di carta e posizionare un colino con una dimensione dei pori compresa tra 0,5 e un millimetro su un becher. Risciacquare il contenuto del piatto di deposizione delle uova nel colino sotto acqua del rubinetto che scorre delicatamente. I granelli di sabbia cadranno attraverso la rete del colino nel becher sottostante mentre le uova di grillo rimangono nel cesto del colino.
Riempire un contenitore con acqua osmosi inversa e posizionare in un vassoio. Invertire il colino sul contenitore e toccarlo contro il piatto per spostare le uova nell'acqua. Le uova affonderanno sul fondo del contenitore.
Quindi, utilizzare le forbici per tagliare la punta da una punta della pipetta P1000 per effettuare un'apertura di circa tre millimetri di diametro. Posizionare questo suggerimento su una pipetter P1000 e utilizzarlo per trasferire le uova dal contenitore al piatto di stampi per uova di agarosio. Usando una pinzetta di plastica, allineare le uova nei pozzi di agarosio.
Ogni uovo affonderà sul fondo di un pozzo individuale. Coprire la piastra di Petri con un coperchio fino a quando non è pronto per l'iniezione. Per iniziare, posizionare il piatto di uova al microscopio di sezionamento e selezionare un basso ingrandimento di circa 10x.
Elaborare 1,5 microlitri di soluzione di iniezione utilizzando 20 punte di carico microlitri e una pipetta P10 e inserire la punta di carico nell'estremità larga dell'ago di iniezione. Espellere la soluzione di iniezione nell'ago di iniezione. Inserire l'ago nell'alloggiamento di iniezione e stringere, assicurandosi che l'ago sia inserito correttamente e saldamente nell'alloggiamento.
Quindi inserire con cura l'alloggiamento di iniezione nel micromanipolatore, facendo attenzione a non rompersi o essere feriti dall'ago. Mentre guardi sia le uova che l'ago attraverso il microscopio, sposta l'ago vicino alla X nell'angolo in alto a sinistra della griglia del piatto. Abbassare l'ago fino a quando la punta entra nella soluzione tamponata hbs più streptomicina penicillina nel piatto.
Centrare l'ago nel campo visivo e spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia di pochi millimetri più vicino al bordo del piatto rispetto alle uova. Successivamente, impostare il microscopio sul filtro appropriato per la rodiammina per osservare la fluorescenza nell'ago e concentrarsi sulla sua punta. Sul microiniettore ruotare lentamente la manopola di bilanciamento in senso orario fino a quando la soluzione di iniezione inizia a fuoriuscire dall'ago nella soluzione di sospensione.
Quindi ruotare leggermente la manopola in senso antiorario fino a quando il colorante smette di fuoriuscire dall'ago. Con l'ago ancora centrato nel campo visivo, spostare il piatto dell'uovo in modo che l'ago sia rivolto all'uovo da iniettare per primo. Regola l'ingrandimento a circa 50x in modo che un singolo uovo riempia la maggior parte del campo visivo.
Utilizzare sia il micromanipolatore che la mano sul piatto d'uovo per spostare l'ago in posizione per l'iniezione. Utilizzare il micromanipolatore per far avanzare l'ago e inserire la punta nel primo uovo da iniettare, assicurandosi di inserire l'ago dal 20 al 30% della lunghezza dell'uovo dall'estremità posteriore dell'uovo perpendicolare al lungo asse dell'uovo. Iniettare la soluzione con il pedale di iniezione o il pulsante di iniezione sul microiniettore.
Un piccolo bolo di materiale fluorescente all'interno dell'uovo indicherà un'iniezione riuscita. Dopo questo, ritrarre l'ago dall'uovo. Se l'uovo viene sollevato involontariamente dal suo pozzo dopo la retrazione dell'ago, utilizzare piccole pina per spingere l'uovo di nuovo nel pozzo mentre si ritrae l'ago.
In questo studio, le uova di cricket vengono iniettate usando una tecnica che funge da metodo fondamentale in molti esperimenti, tra cui, a titolo titolo usare la ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica. Il tasso di sopravvivenza è un parametro importante per valutare il successo di questo esperimento. La maggior parte delle uova morte può essere facilmente identificata a vista mentre il tuorlo e il tessuto embrionale all'interno dell'uovo iniziano a ciuffarsi in modo non uniforme, e alla fine la maggior parte del tuorlo migrerà su un lato dell'uovo.
Se valutato dopo quattro o sei giorni, più dell'85% delle uova non iniettate sopravvisse, mentre le uova iniettate con reagenti sperimentali avevano generalmente un tasso di sopravvivenza più basso. Per comprendere i veri effetti della manipolazione sperimentale tentata è necessario controllare tutti gli aspetti dell'iniezione stessa, compresa la puntura dell'ago, l'introduzione di colorante e tampone, o la presenza di RNA a veicolo o a doppio filamento. Il modo in cui si valutano i risultati fenotipico dell'iniezione dipende da ciò che è stato iniettato.
Ad esempio, i cambiamenti fenotipiche come risultato di specifici knockdown di mRNA possono essere evidenti a livello di anatomia grossolana. Se invece un cDNA che codifica per un gene istone 2B taggato EGFP sotto il controllo di un promotore di actina G.bimaculatus viene inserito nel genoma del cricket utilizzando la trasposasi piggyback, diventa possibile visualizzare ogni nucleo nell'uovo usando la fluorescenza per eccitare la proteina 2B taggata EGFP. Regolare il bilanciamento in modo che gli aghi non si intasano è un passaggio critico in questa procedura.
Potrebbe essere necessario apportare diverse regolazioni dopo successive iniezioni poiché il tuorlo a volte intasa la punta dell'ago. Il cricket è un insetto emimetabolo che si ramica basalmente a insetti olometaboli ben studiati come drosophila. Studiare lo sviluppo del cricket ci aiuterà a capire di più sull'evoluzione e lo sviluppo in tutto il regno animale.
Questa tecnica richiede un po 'di pratica. Si consiglia di praticare le iniezioni di controllo fino a quando il tasso di sopravvivenza quattro o cinque giorni dopo l'iniezione è di almeno l'80%
