TO ve TD, sırasıyla JSPS KAKENHI hibe numaraları 19H02970 ve 20H02999 tarafından desteklenmiştir.

1. Laboratuvar kolonilerinin bakımı
<ol><li>Wildtype ve mutant popülasyonlarının bakımı için, düzenli yapay balık maması içeren büyük bir plastik kap (460 mm x 360 mm x 170 mm), üstünde havalandırma deliği bulunan plastik bardaklarda su, böcekleri gizlemek için katlanmış bir kağıt ve yumurta bırakmak için katmanlı pamuk kullanın (Şekil 2A). Tüm T. domestica kültürlerini 37 °C inkübatörlerin içinde tutun ve her kabın içindeki bağıl nemi (RH) %60-%80 olarak ayarlayın. NOT: T. domestica atmosferden su buharını emdiği için11, doğrudan su kaynağına gerek yoktur. Uygun RH, üstte havalandırma deliği içeren plastik bardaklardan veya her kabın içindeki kapaksız bardaklardan su buharı bulunması nedeniyle korunur. Kültürleri içeren tüm bir inkübatörün içinde nemlendirmeye gerek yoktur. Bu protokolde açıklanan koşul altındaki her gelişim aşamasının yaklaşık süresi Şekil 1'de gösterilmiştir. Gelişim hızı sıcaklık ve/veya RH12değiştirilerek ayarlanabilir.</li>
	<li>Periyodik olarak yiyecek ekleyin. Kurumadan önce su ekleyin.</li>
	<li>Yetişkinlerin kirli bir ortamda ve/veya yoğun popülasyonda yumurta bırakmayı bıraktığı göz önüne alındığında, popülasyonları en az 3 ayda bir yeni bir temiz kaba aktarın (bkz. Tartışma).</li>
</ol>2. Yumurta toplama ve mikroenjeksiyon
<ol><li>Kılavuz RNA (gRNA) tasarlama<ol>
<li>Gerekli her hedef için bir gRNA dizisi tasarlayın ve olası hedef dışı tanıma alanlarını kontrol etmek için gRNA dizilerini genom tertibatı ile patlatın.</li>
		<li>GRNA'ları üreticinin talimatlarına göre sentezlemek ve arındırmak8. NOT: Örnek olarak, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı beyaz geninin hedeflenmesi durumunda, 20 bp hedef dizisi tasarlanmış ve iki sentezlenmiş DNA oligonükleotid 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' ve 5'-TTCTAGCTAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' sipariş edilmiştir. DNA şablonu, bu iki oligonükleotid ve ardından PCR amplifikasyonu tavlanarak hazırlandı ve gRNA daha sonra şablondan bir T7 RNA polimeraz ile in vitro olarak yazıldı.</li>
	</ol></li>
	<li>Yumurta toplama kolonileri hazırlayın<ol>
<li>Yaklaşık 20 erkek ve 20 kadın yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış kağıt ve yumurtlama için küçük bir katmanlı pamuk parçası ile orta büyüklükteki bir kaba (200 mm x 150 mm x 90 mm) aktarın(Şekil 2B).</li>
		<li>Genom düzenleme için kullanılacak kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni kurun. NOT: 37 °C'de 8 saat sonra bir koloniden yaklaşık 20-40 yumurta toplanması beklenir. Transfer edilen yetişkinlerin, muhtemelen yeni bir ortama adaptasyon nedeniyle yumurta bırakmaya başlamaları genellikle birkaç gün sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yenileriyle değiştirin.</li>
	<li>Normal 76 mm x 26 mm cam kaydırağa 76 mm x 5 mm çift taraflı bant yerleştirin.</li>
	<li>Sekiz saat sonra, katmanları kümesleri kullanarak ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın.</li>
	<li>Yumurtaları ıslak bir boya fırçası kullanarak çift taraflı bantta hizalayın ve yumurtalar arasında 2 mm mesafeyi koruyun. Tüm yumurtalar, bir yumurtanın boyuna ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir (Şekil 3A). Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın. NOT: Bu protokolde mantar, ıslak ve sıcak durumda hasarlı enjekte edilmiş yumurtalarda hızlı büyür. Çapraz kontaminasyonu ve mantarın genişlemesini önlemek için yumurtalar arasındaki mesafeyi korumak önemlidir.</li>
	<li>GRNA ve Cas9 proteinini sırasıyla 100 ng/μL ve 500 ng/μL'lik son konsantrasyonda karıştırın. Seyreltme için damıtılmış su kullanın. Ribonucleoprotein kompleks oluşumunu teşvik etmek için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından karışımı buzda tutun. NOT: Enjekte edilen miktarı izlemek için enjeksiyon çözeltisine % 1 nihai konsantrasyonda nötr kırmızı eklenebilir.</li>
	<li>GRNA/Cas9 çözeltisinin 2 μL'sini bir mikro doldurucu ile cam enjeksiyon kılcal damarı içine yükleyin. Enjeksiyondan önce çözeltide hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Gerekirse, kabarcıkları çıkarmak için iğneye dokunun. NOT: Bu deneyde, ince bir iğne ucu elde etmek için hazır bir iğne kullanılır (Şekil 3B). Bunun yerine benzer şekle sahip ev yapımı bir iğne kullanılabilir.</li>
	<li>Daha önce gRNA/Cas9 çözeltisi ile yüklenen cam enjeksiyon kılcal damarını manipülatörle donatılmış bir tutucuya sabitleyin ve tutucuyu elektronik bir mikroinjektöre bağlayın.</li>
	<li>Bir dizi enjeksiyon boyunca tıkanmasını ve daha iyi dayanıklılık elde edilmesini önlemek için iğne ucunun şeklini biraz kırarak optimize edin (Şekil 3C'deuygun bir iğne örneği gösterilmiştir). NOT: Bir iğne tıkandığında değiştirilmesi önerilir. Yine tokalarla kırılırsa aynı iğne ile enjekte etmeye devam etmek mümkündür, ancak daha geniş bir uç daha fazla yumurta hasarına yol açar ve hayatta kalma oranını düşürür. T. domestica yumurtaları yumuşak ve kırılgan olduğundan, ince bir iğne ucu tutmak enjeksiyondan sonra yüksek hayatta kalma oranına sahip olmak için anahtardır.</li>
	<li>İğneyi bir yumurtanın boyuna ekseninin orta noktasına yerleştirin ve çözeltinin hafif bir miktarını enjekte edin (enjeksiyon miktarına referans için Şekil 3D-H'ye bakın). İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikroenjektörün konfigürasyonunu ayarlayın. NOT: Enjeksiyon sırasında sabit bir basınç uygulanması önerilir, aksi takdirde yapışkan yumurta içeriği cam iğneye kolayca akabilir ve tıkayabilir. Çözüm, enjekte edilen sıvı miktarına bağlı olarak kısa bir basınç darbesi veya sabit bir basınçla enjekte etmek olabilir. Bir iğne ucu geniş bir açıklığa sahip olduğunda, bir yumurtaya çok fazla çözelti enjekte edildiğini ve bunun ölümcülliğe neden olduğunu unutmayın (Şekil 3F-H). Bu durumda, sabit basınçla sabit bir sıvı akışı sağlayın, ardından iğneyi bir yumurtaya yerleştirin ve hemen çekin. Çok fazla taşma veya yumurta patlamasına neden olursa, iğneyi değiştirin.</li>
	<li>Enjekte edilen yumurtaları% 60-80 RH ve 37 ° C ile enjekte edilen yumurta sayısına uygun boyutta bir kapta tutun (<20 yumurta: küçük tabak; >20 yumurta: orta boy kap).</li>
</ol>3. Çiftleşme
<ol><li>Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar büyümesini önlemek için hasarlı yumurtaları tokmaklarla atın (Şekil 3I,J). Bir yumurtada çok fazla mantar yetişmesi durumunda, yumurtanın yüzeyini% 70 EtOH ile temizleyin.</li>
	<li>Kuluçkadan önce (yumurtlamadan sonra 37 °C'de yaklaşık 10 gün), çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla cam kaydırağı talk tozuna batırın. Bu, yumurtadan çıkmış nimflerin istiflenerek önlenmesini önleyecektir. Toz kaplı cam slaytları, böceklerin saklanması için yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın.</li>
	<li>Nimfler yumurtadan çıktıktan sonra cam slaytları çıkarın. Yetişkinliğe ulaşana kadar periyodik olarak yiyecek tedarik edin. NOT: Bireylerin yumurtadan çıktıktan sonra yetişkinliğe ulaşması yaklaşık 2,0-2,5 ay sürer (Şekil 1A). Yetişkin aşaması kadınlarda iyi gelişmiş bir ovipozitöre göre değerlendirilmektedir (Şekil 1B).</li>
	<li>Bireyleri çiftleşmek için, bir laboratuvar kolonisinden orta büyüklükteki kaba gerektiği kadar wildtype kadın yetişkin aktarın ve bakir olduklarından emin olmak için 37 ° C'de en az 14 gün kuluçkaya yatırın. NOT: Bir laboratuvar kolonisinden bakire dişileri toplamak gerekli değildir, çünkü yetişkin T. domestica"üreme ve kalıplama döngüsü" adı verilen tekrarlanan bir kalıplama ve çiftleşme döngüsüne sahiptir, bu sırada dişiler her eriyikle spermleri atar ve bir sonraki döllenme döngüsünde tekrar çiftleşir13.</li>
	<li>Enjekte edilmiş bir yumurta ve wildtype yetişkin(ler) ile geliştirilen bir erkek veya dişi G0 yetişkinini yiyecek, katlanmış kağıt ve G1 yumurtalarını döşemek için küçük bir pamuk parçası(Şekil 2C'; çiftleşme kabı) ile küçük bir plastik tabağa aktarın. Çiftleşme yemeklerini% 60-% 80 RH (Şekil 2C)ile daha büyük bir kapta tutun. NOT: Bire bir eşleştirme ile yüksek başarı oranları elde edilmiş olmasına rağmen, başarılı çiftleşme şansını artırmak için bir yemeğe birden fazla wildtype yetişkin dahil edilebilir.</li>
</ol>4. Genotipleme
<ol><li>GRNA tarafından hedeflenen siteyi içeren 100-200 bp'lik bir ürünü yükseltmek için her gRNA için PCR astar çiftleri tasarlayın. Özgüllüğünü kontrol etmek için genom tertibatının her astar dizisini PATLATIN (Şekil 4A'da beyaz genin hedeflenmesi için bir örnek gösterilmiştir).</li>
	<li>G0 yetişkinlerinin mikrop çizgisi dönüşümlerini kontrol edin.<ol>
<li>Yumurtalar bırakıldıktan beş gün sonra, her G0 yetişkin çiftinden ayrı G1 yumurtalarını 0,2 mL tüplere toplayın (tüp başına bir yumurta; toplanan örnekleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). Yumurtaları toplamak için pamuk katmanlarını ayırın. NOT: Germline iletiminin başarısını değerlendirmek için her çiftleşme çiftinden en az 12 G1 nimf genotiplenmesi önerilir (bkz. Temsili Sonuçlar).</li>
		<li>Her tüpe 15 μL 0,25 mg/mL Proteinaz K çözeltisi (Tris-EDTA tamponunda çözünmüş) ekleyin, örnekleri kürdanla kısaca homojenize edin ve 55 °C'de 3 ila 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye yerleştirerek Proteinaz K'yi devre dışı bırak.</li>
		<li>Her tüpe 90 μL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın. Adım 4.1'de tasarlanan astarları içeren 10 μL PCR reaksiyon karışımında 2 μL süpernatant kullanın. NOT: Yeterli PCR amplifikasyonuna ulaşmak için ham şablonlar için optimize edilmiş bir DNA polimerazının kullanılması önerilir.</li>
		<li>PCR ürünlerini analiz etmek için mikroçip elektroforez sistemi ile heteroduplex hareketlilik tahlili (HMA) gerçekleştirin (Şekil 3B; bkz. Ohde vd., 2018)8. NOT: Mutasyonlar iki alternatif yöntemle değerlendirilebilir: (1) %8 poliakrilamid14gibi standart jel polimerli HMA; (2) T7 endonucleaz ile PCR ürünlerinin sindirimi ve ardından agarose jel elektroforez15.</li>
		<li>Sadece mikroplarında mutasyon içeren G0 yetişkinlerinden kaynaklanan G1 nimflerini saklayın ve diğerlerini atın.</li>
	</ol></li>
	<li>G1 nimflerinin/yetişkinlerinin bireysel genotiplemi<ol>
<li>G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 kuyulu plakalarda izole edin. %60–80 RH(Şekil 1D)tutmak için 24 kuyu plakalarını yukarıda açıklandığı gibi su kaynağı olan daha büyük bir kaba (örneğin, bu protokolde kullanılan orta büyüklükteki kap) yerleştirin. Yapay düzenli balık yemi tedarikini koruyun(Şekil 1D'). NOT: Bu adım nem ve yetişkin aşamalarının herhangi bir noktasında yapılabilmesine rağmen, yetişkinliğe ulaştıktan sonra ve eşleştirmeden hemen önce (enjeksiyondan 2,5 ay sonra) yapılması önerilir; Şekil 1B) çünkü ateş aşındırıcıları büyük bir kapta tutmak daha kolaydır. Aşağıdaki adımlarda her G1 nimfinin genotipini izlemek için bireysel yetiştirme gereklidir. Aynı G0 yetişkininden G1 nimfleri farklı mutasyonlara sahip olabilir.</li>
		<li>Cerci ve kaudal filamenti forseps kullanarak bir nimf / yetişkinden kıstırın ve çekin ve 50 μL EtOH içeren 0,2 mL'lik bir tüpe toplayın (toplanan numuneleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). NOT: Doku örnekleri EtOH'da toplanır, çünkü statik elektrik nedeniyle bu küçük numunelerin kaybını önler. Böceklerin hareketini durdurması gerekiyorsa, doku örnekleri alırken nemsiz / yetişkini buz üzerinde uyuşturun. T. domestica buz üzerinde uzun süreli soğudktan sonra hayatta kalamayacağından, onları bir dakikadan fazla uyuşturmayın ve hemen oda sıcaklığına geri taşıyın. Cerci ablasyon ve kaudal filament mortalite artışına neden olmaz.</li>
		<li>EtOH'u buharlaşmak için kapakları açık olan numune tüplerini 70 °C'de 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Genotipleme için 4.2.2–4.2.5 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Mutant bant deseninin gözlendiği PCR ürünlerini standart bir Sanger sıralama hizmetine gönderin.</li>
		<li>G1 nimflerini/yetişkinlerini istenen mutasyonlarla tutun ve diğerlerini atın (temsili bir sıralama sonucu için Şekil 4C'ye bakın).</li>
	</ol></li>
	<li>Bir çiftleşme kabında istenen mutasyonları içeren yetişkinleri geçin ve homozigöz bir mutant suşu oluşturmak için sonraki nesilleri elde edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CRISPR/Cas9 ile istenen T. domestica mutantının başarılı bir şekilde üretilmesi için öncelikle enjeksiyon için yeterli sayıda aşamalı embriyo toplanması önemlidir. Yeterli sayıda T. domestica yumurtasının sürekli toplanması için anahtar, daha düşük bir nüfus yoğunluğuna sahip olmak için kabın uygun bir boyutunu seçmektir, çünkü her yetişkin eriyikten sonra tekrarlanan bir dizi karmaşık çiftleşme davranışının başarılı bir şekilde tamamlanmasına yardımcı ol...

Thermobia domestica, atalardan kalma ametabolöz ve kanatsız bir yaşam döngüsünü koruyan en bazal böcek emirlerinden biri olan Zygentoma'ya aittir. Bu bazal filogenetik pozisyon ve atasal özellikler, bu türü, tanımlanan hayvan türlerinin% 70'inden fazlasını kapsayan Dünyadaki böceklerin başarısının altında kalan mekanizmaları incelemek için çekici bir model olarak belirledi1. T. domestica, nispeten kısa bir yaşam döngüsü (embriyodan üreme yetişkinine 2,5-3,0 ay) gibi laboratuvar modeli olarak uygun özellikleri nedeniyle böcek fizyolojisinin ata özelliklerini incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır; Şekil 1A) ve kolay bir üreme. Son otuz yılda, vücut planı, nöral farklılaşma ve sirkadiyen ritimler 2,3,4gibi çeşitli özelliklerin ata özelliklerini araştırmak için kullanımı genişletilmiştir.
T. domestica'da ileri genetik araçların uygulanması, geniş bir araştırma alanında bu tür katkıları daha da hızlandırabilir. Embriyolarda, nimflerde ve yetişkinlerde başarılı RNA paraziti (RNAi)- aracılı gen devrilmesi T. domestica4, 5,6'da bildirilmiştir. Sistemik RNAi'nin verimliliği hala türlere son derece bağımlıdır — örneğin, genellikle coleoptera'da yüksektir, lepidoptera sırasında ise düşüktür7. T. domestica'daki RNAi nakavtının etkinliği ve süresi henüz değerlendirilmedi. RNAi'ye ek olarak, daha önce T. domestica8'debaşarılı bir CRISPR / Cas9 aracılı gen nakavt bildirdik. CRISPR/Cas sistemi, böceklerde genom düzenlemesi için özellikle hedeflenen gen nakavtları için yaygın olarak uygulanmıştır. Kullanımı, CRISPR/ Cas sisteminin bileşenlerini çekirdek9'ateslim etmek için bir protokol kurulduktan sonra eksojen yapıları devirerek gen muhabiri tahlili, hücre soyu takibi ve transkripsiyonal aktivitenin manipülasyonu gibi diğer uygulamalar için genişletilebilir. Yayınlanan genom derlemesi10ile birlikte, CRISPR/ Cas tabanlı genom düzenlemenin T. domestica'da geniş kullanımı ve daha da geliştirilmesi, böceklerin olağanüstü adaptif başarısının arkasındaki evrimsel mekanizmalara odaklanan çalışmaları kolaylaştıracaktır. Burada, embriyo mikroenjeksiyonu ve CRISPR/Cas9 kullanarak mutant suşu oluşturmak için yetişkin T. domestica'nın çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yeni yöntemi göz önünde bulundurarak, bu tekniklerin başarılı uygulamaları için geleneksel olmayan model türlerinin benzersiz biyolojisini göz önünde bulundurmanın önemini tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

Ateş aşındırıcı Thermobia domestica, yeryüzünde başarılı evrimsel radyasyonlarına yol açan böceklerin gelişim mekanizmalarını incelemek için uygun ametabolous, kanatsız bir türdür. Genom düzenleme gibi genetik araçların uygulanması, Evo-Devo yaklaşımında evrimsel geçişlerden sorumlu olan genetik değişiklikleri anlamanın anahtarıdır. Bu yazıda, T. domestica'nınmutant suşlarını üretmek ve sürdürmek için mevcut protokolümüzü açıklıyoruz. Bildirilen ıslak enjeksiyon yöntemine alternatif olarak, enjekte edilen embriyolarda stably yüksek sağkalım oranları elde etmemizi sağlayan bir kuru enjeksiyon yöntemi rapor ediyoruz. Ayrıca yetişkinleri çiftleşmek ve sonraki nesilleri yüksek verimlilikle elde etmek için optimize edilmiş bir ortam ayarı bildiriyoruz. Yöntemimiz, genom düzenleme yöntemlerinin geleneksel olmayan model organizmalara başarılı bir şekilde uygulanması için her türün benzersiz biyolojisini dikkate almanın öneminin altını çizmektedir. Bu genom düzenleme protokollerinin T. domestica'nın bir laboratuvar modeli olarak uygulanmasına ve bu türdeki yararlı genetik araçların geliştirilmesini ve uygulanmasını daha da hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.

Elimizde, yeterli ipucuna sahip olduğunda yaklaşık 100 yumurta tek bir enjeksiyon kılcal damarı ile iyi enjekte edilebilir (Şekil 3C). Yumurtlamadan sonraki ilk 8 saat içinde embriyolarda gRNA/Cas9 ribononiklioprotein kompleksi enjeksiyonu gRNA hedefli bölgede indels ile sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin (G0) bazı hücrelerinde biallelik mutasyonlara neden olur ve bu nedenle mutant mozaik fenotipleri genellikle G0'de elde edilir. Örneğin, bu protokol beyaz geni hede...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Görüntüleme.  Kyoto University. Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Gelişim Biyolojisi

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Davranış

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biyomühendislik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biyoloji

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...