TO と TD はそれぞれ、JSPS KAKENHI 認可番号 19H02970 と 20H02999 によってサポートされました。

1. 実験室コロニーのメンテナンス
<ol><li>野生型および変異体集団の維持のために、通常の人工魚の食糧を備えた大きいプラスチック容器(460 mm x 360 mm x 170 mm)、上部に換気穴があるプラスチックコップの水、昆虫を隠す折り紙、そして卵を産む層状綿を使用する(図2A)。すべての T.家産 培養物を37°Cインキュベーター内に保管し、各容器内の相対湿度(RH)を60~80%に設定します。 注 :T.家電は 大気11から水蒸気を吸収するので、直接給水は必要ありません。適切なRHは、上部に換気穴を含むプラスチックカップまたは各容器内の蓋なしのカップからの水蒸気の存在のために維持される。培養物を含むインキュベーター全体の中で加湿する必要はありません。このプロトコルで説明されている条件下での各開発段階の概算の持続時間を 図 1に示します。発達速度は、温度やRH12を変更することによって調整することができます。</li>
	<li>定期的に食べ物を追加します。水が乾く前に水を加えます。</li>
	<li>成人が汚れた環境や人口密度の高い環境で卵を産むのをやめていることを考えると、少なくとも3ヶ月ごとに新しいクリーンコンテナに集団を移す( 議論を参照)。</li>
</ol>2. 卵の採取とマイクロインジェクション
<ol><li>ガイドRNA(gRNA)を設計する<ol>
<li>必要な各標的に対してgRNA配列を設計し、ゲノムアセンブリに対してgRNA配列をBLASTして、可能なオフターゲット認識部位をチェックする。</li>
		<li>メーカーの指示に従ってgRNAを合成し、精製する 8. 注:例として、ATP結合カセットトランスポーター 白色 遺伝子を標的とする場合、20bp標的配列を設計し、2つの合成DNAオリゴヌクレオチド5'-TAATACGACTATATATAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGAC-3'および5'TTCTAGCTCTAAAACATCGCGCGCGCGCGGTACAACACTTA-3'を命じた。DNAテンプレートは、これら2つのオリゴヌクレオチドをアニールしてPCR増幅し、次いでgRNAをT7 RNAポリメラーゼで鋳型からインビトロに転写して調製した。</li>
	</ol></li>
	<li>卵のコレクションのコロニーを準備します<ol>
<li>約20人の男性と20人の女性の成人を中型容器(200mm x 150mm x 90 mm)に、食料、給水、折り紙、および産卵用の小さな層状コットンを入れ替える(図2B)。</li>
		<li>ゲノム編集に使用する短期間で多数の段階的胚を得るために、いくつかのコロニーを設定する。 注:約20〜40個の卵は、37°Cで8時間後にコロニーから採取される予定です。 通常、新しい環境への適応のために、転勤の成人が卵を産み始めるのに数日かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>注射の日に、容器の中の綿を新しいものに交換してください。</li>
	<li>76 mm x 5 mm 両面テープを通常の 76 mm x 26 mm ガラス スライドに貼ります。</li>
	<li>8時間後、鉗子を使用して層を分離することによって、層状綿から卵を収集します。</li>
	<li>濡れたペンキのブラシを使って両面テープに卵を合わせ、卵の間に2mmの距離を保ちます。卵の縦軸が注入側に向かるように、すべての卵の向きを設定する必要があります(図3A)。注入の間にしっかり保持するためのペイントブラシで卵をそっと押し下げます。 注:このプロトコルでは、真菌は濡れた暖かい状態で損傷した注入された卵で速く成長します。卵の間の距離を保ち、クロス汚染や真菌の膨張を防ぐことが重要です。</li>
	<li>gRNAとCas9タンパク質を、それぞれ100 ng/μLと500 ng/μLの最終濃度に混合します。蒸留水を希釈に使用してください。リボヌクレオタンパク質複合体形成を促進するために室温で10分間ミックスをインキュベートし、氷の上にミックスを保ちます。 注:1%の最終濃度でニュートラルレッドを注入溶液に加える可能性があり、注入された量を監視することができます。</li>
	<li>マイクロローダーを使用してガラス注入キャピラリーにgRNA/Cas9溶液の2μLをロードします。注入前に溶液に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、針をタップして気泡を取り除きます。 注: この実験では、既製の針を使用して細かい針先を得ます(図3B)。代わりに、似たような形の自家製針を使用することができます。</li>
	<li>以前にgRNA/Cas9溶液を搭載したガラス注入毛細管をマニピュレータを装備したホルダーに固定し、ホルダーを電子マイクロインジェクターに接続します。</li>
	<li>針先の形状を、詰まりを防ぎ、一連の注射を通してより優れた耐久性を得るために鉗子でわずかに壊すことによって、針先の形状を最適化します(適切な針の例を 図3Cに示します)。 メモ:詰まった針を変更することをお勧めします。鉗子で再び壊れた場合、同じ針を注入し続けることは可能ですが、より広い先端はより多くの卵の損傷をもたらし、生存率を低下させる。 T.家畜卵 は柔らかく壊れやすいので、注射後の生存率が高いために細かい針先を保つことが重要です。</li>
	<li>卵の縦軸の中点に針を挿入し、わずかな量の溶液を注入します(注射量の参照については 図3D–H を参照)。注射時に、針先の形状に応じて電子マイクロインジェクターの構成を調整します。 注:注射中に一定の圧力を加えることをお勧めします、そうでなければ粘着性の卵の内容物は、ガラス針に簡単に流れ込み、それを詰まらせることができます。溶液は、注入される液体の量に応じて、短い圧力パルスまたは一定の圧力で注入することができる。針の先端が広い開口部を持つ場合、あまりにも多くの溶液が卵に注入され、致死性を引き起こすことに注意してください(図3F-H)。その場合、一定の圧力で液体の流れを一定に保ち、針を卵に挿入してすぐに引き出します。それがあまりにも多くのオーバーフローを引き起こすか、卵が破裂した場合は、針を変更します。</li>
	<li>注入した卵の数に適したサイズの容器に入れておきます (<20 卵: 小皿; >20卵: 中型容器) 60%-80% RHと37 °C.</li>
</ol>3. 交配
<ol><li>注入された卵を定期的にチェックし、損傷した卵を鉗子で捨てて真菌の増殖を避ける(図3I,J)。卵の上にあまりにも多くの真菌が成長している場合は、70%のEtOHで卵の表面をきれいにします。</li>
	<li>孵化前(産卵後37°Cで約10日間)、注入した卵を入れたガラススライドをタルカムパウダーに浸し、両面テープの表面をコーティングします。これは、孵化したニンフの積み重ねを避けるでしょう。粉末コーティングされたガラススライドを、昆虫を隠すために食べ物、水、折り畳まれた紙を入れた中型容器に移します。</li>
	<li>ニンフが孵化した後、ガラスのスライドを取り外します。成人になるまで定期的に食料を供給する。 注:孵化後、成人に達するまでに約2.0~2.5ヶ月かかります(図1A)。成人期は、女性の発達したオビポジターに基づいて判断される(図1B)。</li>
	<li>個人を交尾するには、必要な数の野生型の女性成人を実験室のコロニーから中型容器に移し、37°Cで少なくとも14日間インキュベートして処女であることを確認します。 注:成人T.家畜は「生殖と脱皮サイクル」と呼ばれる脱皮と交配の繰り返しサイクルを持っているので、実験室のコロニーから処女の女性を収集する必要はありません。</li>
	<li>注射卵と野生型の大人から発達したオスまたはメスのG0成人を、食べ物、折り紙、G1卵を産む綿の小片を入れた小さなプラスチック皿(Ø 100 mm x 40 mm)に移します(図2C';交配皿)。交配皿を60%~80%RHの大きな容器に入れておいてください(図2C)。 注:1対1のペアリングで高い成功率が達成されているが、成功率が高いが、成功率が高いが、複数の野生型の大人を皿に含めることができる。</li>
</ol>4. ジェノタイピング
<ol><li>各gRNAにPCRプライマーペアを設計して、gRNAの標的部位を含む100~200bpの産物を増幅します。その特異性を確認するためにゲノムアセンブリに対して各プライマー配列をBLASTする(図4Aにおける白色遺伝子の標的化の例を示す)。</li>
	<li>G0成人の生殖系列変換を確認してください。<ol>
<li>卵が産まれた5日後、各G0成人ペアから0.2mLチューブに個々のG1卵を採取する(1株当たり1個の卵、収集したサンプルを-20°Cで長期保存する)。卵を収集するために綿の層を分離します。 注:生殖系列伝達の成功を評価するために、各交配ペアから少なくとも12 G1ニンフを遺伝子型化することをお勧めします( 代表結果を参照)。</li>
		<li>各チューブに0.25 mg/mLプロテイナーゼK溶液(トリスEDTAバッファーに溶解)を15μL加え、サンプルを爪楊枝で短時間均質化し、55°Cで3〜16時間インキュベートします。</li>
		<li>95°Cで10分間サンプルを配置することにより、プロテアーゼKを不活性化します。</li>
		<li>各チューブに90μLの蒸留水を加え、よく混ぜます。ステップ4.1で設計されたプライマーを含む10 μL PCR反応ミックスで2μLの上清を使用してください。 注: 粗テンプレート用に最適化された DNA ポリメラーゼを使用すると、十分な PCR 増幅が得られるようにすることをお勧めします。</li>
		<li>PCR産物を解析するには、マイクロチップ電気泳動システムを用いてヘテロデュプレックスモビリティアッセイ(HMA)を実行する(図3B;Ohdeら、2018を参照)。 注:突然変異は、2つの代替方法で評価することができます:(1)標準ゲルポリマーを有するHMA(例えば8%ポリアクリルアミド14;(2)T7エンドヌクレアーゼを用いたPCR産物の消化、続いてアガロースゲル電気泳動15.</li>
		<li>生殖細胞系列に変異を含むG0成人から生じるG1ニンフのみを保管し、他の人を捨てる。</li>
	</ol></li>
	<li>G1ニンフ/大人の個別ジェノタイピング<ol>
<li>G1ニンフを吸引器またはペイントブラシで24ウェルプレートに分離します。24ウェルプレートを大きな容器(例えば、このプロトコルで使用される中型コンテナ)に、上記のように給水で配置し、RHを60%~80%に保つ(図1D)。人工的な通常の魚の食糧の供給を維持する(図1D')。 注:このステップはニンガルステージと成人段階のどの時点でも実行できますが、成人期に達した後、ペアリングの直前に実行することをお勧めします(>注射後2.5ヶ月; 図 1B)大きな容器にファブラットを維持する方が簡単だからです。個々の飼育は、次の手順で各G1ニンフの遺伝子型を追跡するために必要とされる。同じG0成体からのG1ニンフは異なる突然変異を有することができる。</li>
		<li>鉗子を使用してニンフ/成体からcerciとコーダルフィラメントをつまんで引っ張り、50 μL EtOHを含む0.2 mLチューブに集めます(収集したサンプルを-20°Cで長期保存してください)。 注:ティッシュサンプルは静電気によるこれらの小さいサンプルの損失を防ぐのでEtOHで集められる。昆虫の動きを止める必要がある場合は、組織サンプルを採取する際に氷上でニンフ/成体を麻酔します。 T.家畜は 氷の上で長期間冷却した後に生き残ることができないので、1分以上麻酔せず、すぐに室温に戻してください。セルシと尾状フィラメントのアブレーションは、死亡率の増加を引き起こさない。</li>
		<li>サンプルチューブを熱ブロックに開けて70°Cで15分間開き、EtOHを蒸発させておきます。</li>
		<li>ジェノタイピングの場合は、ステップ 4.2.2 ~ 4.2.5 を繰り返します。</li>
		<li>変異バンドパターンが観察されたPCR産物を、標準のサンガーシーケンシングサービスに提出します。</li>
		<li>G1ニンフ/成人に所望の変異を保持し、他の変異を破棄します(代表的なシーケンス結果については 図4C を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>交配皿に所望の突然変異を含む成人を渡り、次の世代を得てホモ接合突然変異株を確立する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

CRISPR/Cas9を用いた所望の T.家畜 変異体の生成に成功するためには、注射のために十分な数の段階的胚を収集することが最初に重要である。十分な数の T.家畜 卵の一定のコレクションの場合、重要なのは、すべての成体モルト13の後に繰り返される一連の複雑な交配行動の正常な完了を助けるので、より低い人口密度を有する容器の適切なサイズを選択すること?...

熱藻家畜は、最も基礎的な昆虫の注文の1つに属しています, Zygentoma, 先祖の代謝と翼のないライフサイクルを保持します.このような基底系統的位置と先祖の特徴は、この種を地球上の昆虫の成功の基礎となるメカニズムを研究するための魅力的なモデルとして設定し、記述された動物種の70%以上をカバーする1。T. 家産は、比較的短いライフサイクル(胚から生殖成人までの2.5~3.0ヶ月)などの実験室モデルとして適した特徴があるため、主に昆虫生理学の祖先特性を研究するために主に使用されてきました。図 1A)そして簡単な繁殖。過去30年間で、ボディプラン、神経分化、概日リズム2、3、4などの様々な形質の祖先の特徴を調査するために、その使用が拡大されました。
T.家産における高度な遺伝ツールの適用は、広い研究分野におけるこのような貢献をさらに加速させる可能性がある。胚、ニンフ、および成人におけるRNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウンがT.家畜4、5、6で報告されている。全身RNAiの効率は依然として種に依存性が高く、例えば、コレオプテラでは一般的に高いが、鱗翅目の順序は7.T.ドメダナのRNAiノックダウンの効率と持続時間はまだ評価されていません。RNAiに加えて、我々は以前にT.家産8で成功したCRISPR /Cas9媒介遺伝子ノックアウトを報告しました。CRISPR/Casシステムは、特に標的遺伝子ノックアウトの昆虫のゲノム編集に広く応用されています。その使用は、CRISPR/Casシステムの成分を核9に送達するためのプロトコルの確立後に、遺伝子レポーターアッセイ、細胞系譜追跡、およびノッキングイン外因性構造による転写活性の操作などの他の用途に拡大することができる。公表されたゲノムアセンブリ10と組み合わせることで、T.家畜におけるCRISPR/Casベースのゲノム編集の広い使用とさらなる発展は、昆虫の顕著な適応成功の背後にある進化メカニズムに焦点を当てた研究を容易にするだろう。ここでは、胚微小注入とCRISPR/Cas9を用いて変異株を生成する成人T.家産を交配するための詳細なプロトコルについて説明する。この新しい方法を考えると、我々はこれらの技術の成功した応用のための非伝統的なモデル種の独特な生物学を考慮することの重要性を議論する。

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

ファブレット サーモビア家畜は 、地球上で成功した進化放射線につながった昆虫の発達メカニズムを研究するのに適した代謝された翼のない種です。ゲノム編集などの遺伝的ツールの応用は、Evo-Devoアプローチにおける進化的移行を担う遺伝的変化を理解する鍵です。この記事では 、T.家産の変異株を生成し、維持するための現在のプロトコルについて説明します。我々は、報告された湿式注入法の代替として、注入された胚において安定的に高い生存率を得ることを可能にする乾燥注入方法を報告する。また、成人との交尾を行い、その後の世代を高効率で取得するための最適化された環境設定を報告します。我々の方法は、非伝統的なモデル生物にゲノム編集方法をうまく適用するために、種固有の生物学を考慮に入れる重要性を強調している。これらのゲノム編集プロトコルは 、T.家畜 を実験室モデルとして実施し、この種における有用な遺伝ツールの開発と応用をさらに加速させるのに役立つと予測しています。

私たちの手では、十分な先端を持っている場合、約100個の卵が単一の注射毛細管で十分に注入することができます(図3C)。産卵後の最初の8時間以内に胚中にgRNA/Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を注射すると、gRNA標的部位にインデルが生じる。これは、注入された生成のいくつかの細胞(G0)におけるビアレスリック突然変異を引き起こし、したがって変異モザイクの型は...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K ビュー.  Kyoto University. 我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

遺伝学

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

発生生物学

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

行動学

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

生物工学

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

生物学

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

秋ミミミズ、スポドプテラ・フルギペルダにおける超活性ピギーバツトランスポザーゼ媒介性生殖細胞変容

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

要約

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世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

マイクロインジェクションウエスタントウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

秋ミミミズ、スポドプテラ・フルギペルダにおける超活性ピギーバツトランスポザーゼ媒介性生殖細胞変容

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

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世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

秋ミミミズ、スポドプテラ・フルギペルダにおける超活性ピギーバツトランスポザーゼ媒介性生殖細胞変容

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

マイクロインジェクションウエスタントウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション