TO ו- TD נתמכו על ידי JSPS KAKENHI מענק מספרים 19H02970 ו 20H02999, בהתאמה.

1. תחזוקת מושבות מעבדה
<ol><li>לשמירה על אוכלוסיות של דגים מלאכותיים ומוטנטים, השתמשו במיכל פלסטיק גדול (460 מ"מ x 360 מ"מ x 170 מ"מ) עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים ב כוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים (איור 2A). שמור את כל תרבויות T. domestica בתוך 37 °C (70 °F) חממות ולהגדיר את הלחות היחסית (RH) בתוך כל מיכל ל 60%-80%. הערה: מכיוון ש- T. domestica סופג אדי מים מהאטמוספירה11, אין צורך באספקת מים ישירה. RH המתאים נשמר בשל נוכחות של אדי מים מכוסות פלסטיק המכיל חור אוורור בחלק העליון או כוסות lidless בתוך כל מיכל. אין צורך לחות בתוך אינקובטור שלם המכיל תרבויות. משך הזמן המשוער של כל שלב התפתחותי בתנאי המתואר בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. המהירות ההתפתחותית יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי הטמפרטורה ו / או RH12.</li>
	<li>מוסיפים אוכל מעת לעת. מוסיפים מים לפני שהם מתייבשים.</li>
	<li>להעביר את האוכלוסיות למיכל נקי חדש לפחות כל 3 חודשים בהתחשב בכך שמבוגרים מפסיקים להטיל ביצים בסביבה מלוכלכת ו / או אוכלוסייה צפופה (ראה דיון).</li>
</ol>2. איסוף ביצים ומיקרו-יין
<ol><li>עיצוב RNA מדריך (gRNA)<ol>
<li>תכנן רצף gRNA עבור כל מטרה נדרשת ופוצץ את רצפי gRNA נגד הרכבת הגנום כדי לבדוק אתרי זיהוי אפשריים מחוץ ליעד.</li>
		<li>לסנתז ולטהר את gRNAs על פי הוראות היצרן8. הערה: כדוגמה, במקרה של מיקוד הגן הלבן טרנספורטר קלטת מחייב ATP, רצף יעד 20 bp תוכנן ושני אוליגונוקלאוטידים DNA מסונתז 5 '-TAATACGACTCACTACTTAGTAGTGTGGGAC-3' ו 5'-TTCTAGCTCTAAAAכתא-3' הוזמנו. תבנית הדנ"א הוכנה על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים אלה ואחריו הגברה PCR ואת gRNA הוא אז במבחנה מתמלל מן התבנית עם פולימראז T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מושבות איסוף ביצים<ol>
<li>העבירו כ-20 גברים ו-20 נשים מבוגרים למיכל בגודל בינוני (200 מ"מ x 150 מ"מ x 90 מ"מ) עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכת כותנה שכבתית קטנה להנחת ביצים (איור 2B).</li>
		<li>להקים מספר מושבות כדי לקבל מספר גדול של עוברים מבוימים בפרק זמן קצר כדי לשמש לעריכת גנום. הערה: כ-20-40 ביצים צפויות להיאסף ממושבה לאחר 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל לוקח כמה ימים למבוגרים שהועברו להתחיל להטיל ביצים, אולי בגלל הסתגלות לסביבה חדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>ביום ההזרקה, להחליף את הכותנה בתוך המיכלים עם חדשים.</li>
	<li>הנח סרט דו-צדדי בגודל 76 מ"מ x 5 מ"מ על שקופית זכוכית רגילה של 76 מ"מ x 26 מ"מ.</li>
	<li>שמונה שעות לאחר מכן, לאסוף את הביצים מן הכותנה שכבתית על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>מיישרים את הביצים על הסרט הדו-צדדי באמצעות מברשת צבע רטובה ושומרים על מרחק של 2 מ"מ בין הביצים. יש לכוון את כל הביצים כך שציר הביצה האורך יפונה לצד ההזרקה(איור 3A). לחץ בעדינות על הביצים עם מברשת צבע להחזקה מוצקה במהלך ההזרקה. הערה: בפרוטוקול זה, הפטרייה גדלה במהירות בביצים מוזרקות פגומות במצב רטוב וחם. חשוב לשמור על המרחק בין הביצים כדי למנוע זיהום צולב והתרחבות הפטרייה.</li>
	<li>מערבבים את חלבון gRNA ו- Cas9 לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL ו- 500 ng/μL, בהתאמה. השתמש במים מזוקקים לדילול. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקדם היווצרות מורכבת ריבונוקלאופרוטאין ולאחר מכן לשמור את התערובת על הקרח. הערה: אדום ניטרלי בריכוז סופי של 1% ניתן להוסיף לפתרון ההזרקה כדי לפקח על הכמות מוזרקת.</li>
	<li>טען 2 μL של פתרון gRNA / Cas9 נימי הזרקת זכוכית עם microloader. ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך, הקש על המחט כדי להסיר את הבועות. הערה: בניסוי זה, מחט מוכנה משמשת לקבלת קצה מחט עדין (איור 3B). מחט תוצרת בית עם צורה דומה יכול לשמש במקום.</li>
	<li>לתקן את נימי הזרקת זכוכית, טעון בעבר עם הפתרון gRNA / Cas9, למחזיק מצויד מניפולטור ולחבר את המחזיק microinjector אלקטרונית.</li>
	<li>מטב את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט במלקחיים כדי למנוע סתימה ועמידות טובה יותר לאורך סדרה של זריקות (דוגמה למחט מתאימה מוצגת באיור 3C). הערה: מומלץ להחליף מחט כאשר היא סתומה. אפשר להמשיך להזריק עם אותה מחט אם הוא שבור שוב עם מלקחיים, אבל טיפ רחב יותר מוביל יותר נזק לביצה ומוריד את שיעור ההישרדות שלהם. כמו T. ביצים מקומיות הם רכים ושבירים, שמירה על קצה מחט בסדר הוא המפתח שיש שיעור הישרדות גבוה לאחר הזרקה.</li>
	<li>הכנס את המחט לנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזרק כמות קלה של הפתרון (ראה איור 3D-H לעיון בכמות ההזרקה). להתאים את התצורה של microinjector אלקטרונית במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט. הערה: מומלץ להפעיל לחץ מתמיד במהלך ההזרקה, אחרת תכולת ביצה דביקה יכולה בקלות לזרום לתוך מחט הזכוכית ועלולה לסתום אותו. הפתרון עשוי להיות גם להזריק עם דופק לחץ קצר או עם לחץ מתמיד, בהתאם לכמות הנוזל מוזרק. זכור שכאשר לקצה המחט יש פתח רחב, יותר מדי פתרון מוזרק לביצה, מה שגורם לקטלניות (איור 3F-H). במקרה זה, לשמור על זרימה נוזלית מתמדת על ידי לחץ מתמיד, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך ביצה ולמשוך אותו מיד. אם זה גורם יותר מדי גלישה או פרצי הביצה, לשנות את המחט.</li>
	<li>שמור את הביצים המוזרקות במיכל עם הגודל המתאים למספר הביצים המוזרקות (<20 ביצים: צלחת קטנה; >20 ביצים: מיכל בגודל בינוני) עם 60%-80% RH ו 37 °C (67 °F).</li>
</ol>3. הזדווגות
<ol><li>בדקו את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליכו ביצים פגומות במלקחיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית(איור 3I,J). במקרה יותר מדי פטרייה גדל על ביצה, לנקות את פני השטח של הביצה עם 70% EtOH.</li>
	<li>לפני הבקיעה (כ 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לאחר הטלת ביצה), לטבול את שקופית הזכוכית עם הביצים מוזרק לתוך אבקת טלק כדי לצפות את פני השטח של הסרט דו צדדי. זה ימנע את הערימה של נימפות בקעו. מעבירים את מגלשות הזכוכית מצופות האבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל להסתרת החרקים.</li>
	<li>הסר את מגלשות הזכוכית לאחר שהנימפות בקעו. מעת לעת לספק מזון עד שהם מגיעים לבגרות. הערה: לוקח בערך חודשיים וחצי עד שאנשים מגיעים לבגרות אחרי שהם בוקעים (איור 1A). הבמה הבוגרת נשפטת על סמך אוביפוסטור מפותח אצל נקבות (איור 1B).</li>
	<li>כדי להזדווג עם הפרטים, להעביר כמה שיותר מבוגרים נקבות בר הדרושים ממושבת מעבדה למיכל בגודל בינוני ולהדגיר אותם לפחות 14 ימים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהם בתולים. הערה: אין צורך לאסוף נקבות בתולה ממושבת מעבדה כי למבוגרים T. domestica יש מחזור חוזר ונשנה של הזדווגות והזדווגות שנקרא "מחזור הרבייה וההזדווגות", שבמהלכו הנקבות זורקות זרע עם כל molt ומזדווגות שוב במחזור ההפריה הבא13.</li>
	<li>העבירו זכר או נקבה בוגר G0 שהתפתח מביצה מוזרקת ומבוגרים מסוג פראי לצלחת פלסטיק קטנה (100 מ"מ x 40 מ"מ) עם אוכל, נייר מקופל וחתיכת כותנה קטנה להטלת ביצי G1(איור 2C'; צלחת הזדווגות). שמור את מנות ההזדווגות במיכל גדול יותר עם 60%-80% RH(איור 2C). הערה: ניתן לכלול בצלחת מספר מבוגרים מסוג פראי כדי להגדיל את הסיכוי להזדווגות מוצלחת, אם כי שיעורי הצלחה גבוהים הושגו עם זיווג אחד לאחד.</li>
</ol>4. גנוטיפינג
<ol><li>עיצוב זוגות פריימר PCR עבור כל gRNA כדי להגביר מוצר 100-200 bp הכולל את האתר ממוקד על ידי gRNA. BLAST כל רצף פריימר מול מכלול הגנום כדי לבדוק את הספציפיות שלו (דוגמה מוצגת למיקוד הגן הלבן באיור 4A).</li>
	<li>בדוק את טרנספורמציית הנבט של מבוגרי G0.<ol>
<li>חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים. הערה: מומלץ לגנוטיפ לפחות 12 נימפות G1 מכל זוג הזדווגות כדי להעריך את ההצלחה של העברת הנבט (ראה תוצאות מייצגות).</li>
		<li>הוסף 15 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל Proteinase K פתרון (מומס במאגר Tris-EDTA) לכל צינור, בקצרה הומוגניזציה דגימות עם קיסמים, ואת הדגירה ב 55 °C (70 °F) עבור 3 עד 16 שעות.</li>
		<li>להשבית את Proteinase K על ידי הצבת הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 90 μL של מים מזוקקים לכל צינור ומערבבים היטב. השתמש 2 μL של supernatant בתמהיל תגובת PCR μL 10 μL המכיל את פריימרים תוכנן בשלב 4.1. הערה: מומלץ להשתמש בפולימראז DNA המותאם לתבניות גולמיות כדי להגיע למספיק הגברה של PCR.</li>
		<li>כדי לנתח את מוצרי PCR, בצע בדיקת ניידות הטרודופלקס (HMA) עם מערכת אלקטרופורזה של שבב זעיר (איור 3B; ראה Ohde et al., 2018)8. הערה: מוטציות ניתן להעריך עם שתי שיטות חלופיות: (1) HMA עם פולימרים ג'ל סטנדרטי, כגון 8% polyacrylamide14; (2) עיכול של מוצרי PCR עם אנדונוקלאאז T7 ואחריו אלקטרופורזה ג'ל agarose15.</li>
		<li>שמור רק את נימפות G1 הנובעות מבוגרים G0 המכילים מוטציות בנבט שלהם להשליך את האחרים.</li>
	</ol></li>
	<li>גנוטיפינג אישי של נימפות G1 / מבוגרים<ol>
<li>בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D). הערה: למרות שלב זה יכול להתבצע בכל נקודה של שלבי נימפה ומבוגרים, מומלץ לבצע אותו לאחר שהגיע לבגרות ורגע לפני הזיווג (>2.5 חודשים לאחר ההזרקה; איור 1B) כי קל יותר לתחזק כבאיות במיכל גדול. גידול אישי נדרש כדי לעקוב אחר הגנוטיפ של כל נימפה G1 על השלבים הבאים. נימפות G1 מאותו מבוגר G0 יכול להיות מוטציות שונות.</li>
		<li>צבוט ומשוך cerci ואת חוט caudal מנימפה / מבוגר באמצעות מלקחיים ולאסוף אותם לתוך צינור 0.2 מ"ל המכיל 50 μL EtOH (לאחסן את הדגימות שנאספו ב -20 °C (70 °F) עבור אחסון לטווח ארוך). הערה: דגימות רקמה נאספות ב- EtOH מכיוון שהיא מונעת אובדן של דגימות קטנות אלה עקב חשמל סטטי. אם אדם צריך לעצור את התנועה של חרקים, המרדים נימפה / מבוגר על קרח בעת לקיחת דגימות רקמה. כי T. domestica לא יכול לשרוד לאחר קירור לטווח ארוך על קרח, לא להרדים אותם במשך יותר מדקה ומיד להעביר אותם בחזרה לטמפרטורת החדר. אבלציה של cerci ואת חוטי caudal גורם ללא עלייה בתמותה.</li>
		<li>מניחים צינורות מדגם עם העפעפיים פתוחים על בלוק תרמי במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את EtOH.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.2–4.2.5 עבור genotyping.</li>
		<li>שלח את מוצרי ה- PCR שבהם תבנית רצועת מוטנטים נצפתה לשירות רצף סנגר סטנדרטי.</li>
		<li>שמרו על הנימפות/מבוגרים של G1 עם המוטציות הרצויות והשליכו את האחרים (ראו איור 4C לקבלת תוצאת רצף מייצגת).</li>
	</ol></li>
	<li>חוצים את המבוגרים המכילים את המוטציות הרצויות בצלחת הזדווגות ומשיגים את הדורות הבאים כדי ליצור זן מוטנט הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבור הדור המוצלח של מוטציית T. domestica הרצויה עם CRISPR/Cas9, חשוב תחילה לאסוף מספר מספיק של עוברים מבוימים להזרקה. עבור אוסף קבוע של מספר מספיק של ביצי T. domestica, המפתח הוא לבחור גודל מתאים של המיכל יש צפיפות אוכלוסין נמוכה יותר כי זה יעזור להשלים בהצלחה סדרה של התנהגויות הזדווגות מורכבות, א...

Thermobia domestica שייך לאחד ממסדרי החרקים הבסיסיים ביותר, זיג נטומה, השומרת על מחזור חיים אמטבולי וחסר כנפיים של אבות קדמונים. תנוחה פילוגנטית בסיסית כזו ומאפייני אבות מגדירים מין זה כמודל אטרקטיבי לחקר המנגנונים שבבסיס ההצלחה של חרקים על פני כדור הארץ, המכסים מעל 70% ממיני בעלי החיים המתוארים1. T. domestica שימש זמן רב בעיקר כדי ללמוד מאפיינים אבות של פיזיולוגיה חרקים בגלל המאפיינים המתאימים שלה כמודל מעבדה, כגון מחזור חיים קצר יחסית (2.5-3.0 חודשים מעובר למבוגר הרבייה; איור 1A) ורבייה קלה. בשלושת העשורים האחרונים הורחב השימוש בו כדי לחקור מאפיינים של אבות קדמונים של תכונות שונות כגון תוכנית גוף, בידול עצבי ומקצבים צירקדיים2,3,4.
יישום כלים גנטיים מתקדמים ב- T. domestica יכול להאיץ עוד יותר תרומות כאלה בתחום מחקר רחב. הפרעה מוצלחת RNA (RNAi)-בתיווך נפילת גנים בעוברים, נימפות, ומבוגרים דווח ב T. domestica4,5,6. היעילות של RNAi המערכתי עדיין תלויה מאוד במינים - לדוגמה, הוא בדרך כלל גבוה בקולופטרה ואילו הוא נמוך בסדר הלפידופטרה7. היעילות ומשך ההפלה של RNAi ב- T. domestica טרם נבדקו. בנוסף ל- RNAi, דיווחנו בעבר על נוקאאוט גנים מוצלח של CRISPR/Cas9 בתיווך T. domestica8. מערכת CRISPR/Cas הוחלה באופן נרחב לעריכת גנום בחרקים במיוחד עבור נוקאאוט גנים ממוקדים. השימוש בו יכול להיות מורחב עבור יישומים אחרים כגון בדיקת כתב גנים, מעקב אחר שושלת התא, ומניפולציה של פעילות שעתוק על ידי דפיקות במבנים אקסוגני לאחר הקמת פרוטוקול להעברת רכיבים של מערכת CRISPR / Cas לתוך גרעינים9. בשילוב עם הרכבה הגנום שפורסם10, השימוש הרחב ופיתוח נוסף של עריכת הגנום מבוסס CRISPR / Cas ב T. domestica יקל על מחקרים המתמקדים במנגנונים האבולוציוניים שמאחורי ההצלחה המסתגלת יוצאת הדופן של חרקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור microinjection העובר עבור הזדווגות בוגר T. domestica כדי ליצור זן מוטציה באמצעות CRISPR / Cas9. בהתחשב בשיטה חדשנית זו, אנו דנים בחשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של מיני מודלים לא מסורתיים ליישומים מוצלחים של טכניקות אלה.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

תרמוביה הביתית של האש היא מין אמטבולי וחסר כנפיים המתאים לחקר המנגנונים ההתפתחותיים של חרקים שהובילו לקרינה האבולוציונית המוצלחת שלהם על פני כדור הארץ. היישום של כלים גנטיים כגון עריכת גנום הוא המפתח להבנת שינויים גנטיים האחראים על מעברים אבולוציוניים בגישה Evo-Devo. במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול הנוכחי שלנו ליצירת ותחזוקה של זנים מוטנטים של T. domestica. אנו מדווחים על שיטת הזרקה יבשה, כחלופה לשיטת ההזרקה הרטובה המדווחת, המאפשרת לנו להשיג שיעורי הישרדות גבוהים ביציבות בעוברים מוזרקים. אנו מדווחים גם על הגדרת סביבה ממוטבת להזדווגות עם מבוגרים ולקבל את הדורות הבאים ביעילות גבוהה. השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של כל מין ליישום מוצלח של שיטות עריכת גנום לאורגניזמים מודל לא מסורתיים. אנו צופים כי פרוטוקולי עריכת הגנום הללו יסייעו ביישום T. domestica כמודל מעבדה ולהאיץ עוד יותר את הפיתוח והיישום של כלים גנטיים שימושיים במין זה.

בידינו, כ -100 ביצים ניתן להזריק היטב עם נימי הזרקה אחת כאשר יש לו את הקצה המתאים(איור 3C). הזרקה של gRNA / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בעוברים בתוך 8 h הראשון לאחר הטלת ביצה תוצאות indels באתר ממוקד gRNA. זה גורם מוטציות biallelic בתאים מסוימים של הדור מוזרק (G0) ולכן פנוטיפים פסיפס מוטציה מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Views.  Kyoto University. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Behavior

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biology

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...