עבודה זו נתמכה על ידי נדיב, שבוצע באוניברסיטת קליפורניה, מעבדה ריברסייד (UCR) סטארט-אפ לקרן O.S.A, משרד החקלאות המכון הלאומי של המזון, החקלאות (NIFA) פתח פרוייקט (1009509) O.S.A.

1. Vitripennis (ש ע) גידול מושבת
<ol>
	<li>הגדרת מספר מושבות (~ 3-5) על-ידי הצבת 200-500 מבוגרים (ש ע) vitripennis (עם יחס של 3:1 של נקבה: זכר) בכלובים במעונות באג. הערה: חלופה לשימוש באג במעונות, צרעות יכול גם להיות מופצות במבחנות מרובים, םת מחובר עם כותנה עם 15-20 צרעות/מבחנה.<ol>
		<li>לשמור על הצרעות-25 ± 1 ° C עם 30% לחות יחסית, 12:12 אור מחזור כהה, להאכיל אותם מדי יום עם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים. הערה: התפשטות של צרעה מושבות ואוספים יכול להתבצע גם בטמפרטורת החדר ללא לחות מבוקרת; עם זאת, טמפרטורות נמוכים מ- 25 ° C תפחית במקצת את התזמון התפתחותית של העוברים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאפשר צרעות להזדווג לפחות 4 ימים לפני זריקות.<ol>
		<li>במשך היומיים הראשונים, לאפשר נקבות ובסיומה ניזונים טריים הגלמים ס bullata , כמו גם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים.</li>
		<li>במשך היומיים הבאים, הסר את הגלמים זבוב לשלול הצרעות הנשי של אתר ההטלה, הפיכתם gravid מאוד.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. אוסף ויישור של העוברים בשלב טרום blastoderm ש Vitripennis
<ol>
	<li>לאפשר נקבות הצרעה על הדורות (oviposit עוברי) לתוך מארחים צעיר (ס' bullata גלמי). כדי לשמור מארחים טריים, לאחסן מארחים 4 ° C מיד לאחר קבלת אותם ולהסיר רק בעת הצורך. הערה: מארחים צעיר יכול להיקבע על ידי בעל puparium בצבע אדום בעוד מארחים בוגרים יש בצבע כהה יותר puparium (איור 1 א').<ol>
		<li>מקום טריים בודדים bullata ס הגלמים לתוך פקק קצף עם חור בגודל של הגלמים לחתוך לתוך המרכז. לחשוף רק ~ 0.2 ס מ בקצה הקדמי (אתר ההטלה מועדף) של המארחת של ריכוז מרבי של parasitization ואוסף העובר קל יותר. הערה: הסוף קדמי מעוגל, ואילו הקצה האחורי סמיך ומכיל חור 'מכתש דמוי' (איור 1B).</li>
		<li>המקום מארח גלמי (בערך 5 מארח הגלמים לכל הצרעות 100) בסידור זה לתוך הכלוב ולא לחכות בערך 45 דקות כדי לאפשר צרעות הדורות אותם (איור 2- ii). הערה: חשוב מאוד כי העוברים הם צעירים ככל שניתן, באופן אידיאלי בתוך השעה הראשונה של להיות oviposited, כדי להבטיח כי הם בשלב טרום blastoderm. עוברי הישן (&#62; 1.5 h) לא צריך להיות מוזרק.</li>
		<li>להסיר מארחים parasitized על-ידי איחזורם ביד ובעדינות צחצוח/לפוצץ את כל המתגוררים צרעות. להחליף אותם עם המארחים טריים לאחר כל ~ 15 דקות כדי להמשיך באיסוף מוקדם מבוים ביצים במהלך זריקות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הסר את המארחים טרי parasitized כלוב בעבודת יד. תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות מלקחיים, בזהירות הקילוף בקצה האחורי (0.4 ס מ) של puparium החיצוני (מעטפת הגולמי) לחשוף את הביצים (ש ע) vitripennis (איור 2- iii). הערה: יש לנקוט כדי להימנע ניקב העור הגולמי; אם זה יקרה, hemolymph ירטבו העוברים צרעה, אשר יהיה קשה מאוד להסיר על microinjection.</li>
	<li>השתמש דבק נוזלי כדי להדביק את coverslip על זכוכית נקי כדי להכין שקופיות יישור של העובר (איור 3). הערה: דבק מיידית ביצועים גבוהים משמש כדי להגדיל את בונד חוזק, ייבוש מהירות, אולם בדבק כלשהו שיכול למנוע את coverslip לנוע בשקופית מקובל.</li>
	<li>אתה מנסה לחתוך העוברים מהמחשב המארח בזהירות עם מברשת פיין-טיפ רטוב, מוודא שלא יגרמו נזק לעור רך הגולמי של המחשב המארח. הערה: "העובר לבחור," שזה בעצם חצי של זוג מלקחיים חדה במיוחד, ניתן להשתמש במקום במכחול.</li>
	<li>העברת ~ 20 עוברי אחד--אחד על גבי השקופית, ומייד בסמוך לצד של coverslip באמצעות מברשת צבע רטוב. אוריינט בקצה הקדמי של העובר כנגד הקצה של השקופית כיסוי כך באחד העוברים עליה הצבעת באותו כיוון (איור 2- iv). זה יאפשר דיוק גבוה יותר של הזרקת לאותה תנוחה בין כל העוברים. הערה: שיפור טכניקה זו אינה דורשת דו-צדדית קלטת דביק לתקן את העוברים אל השקופית כפי שתואר לעיל21,22. בנוסף, אין וכשתתחילי העוברים, או לכסות את הביצים בשמן halocarbon במהלך ההזרקה כפי שתואר לעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjection22.</li>
</ol>
3. מחט הכנה Microinjections
<ol>
	<li>המקום זכוכית נימי aluminosilicate לתוך פולר המחט. הערה: מחט טובה הוא קריטי עבור מוצלחת vitripennis ש עוברי זריקות. המחטים הזרקת צריך יש שארפ פיין-טיפ כדי לאפשר חדירה קלה דרך chorion. קוורץ ומחטים נימי בורוסיליקט גם יכול להיות בשימוש (איור 4).</li>
	<li>להגדיר את החום 605, את מהירות 130, עיכוב ל-80, משוך 70, ואת הלחץ 500 פולר המחט. הערה: ההגדרות פולר המחט נוספים עבור משיכת קוורץ ומחטים בורוסיליקט ניתן לראות בטבלה 1; הפרמטרים עשויים להשתנות עבור אלו שלוחצים שונים של חוטים.</li>
	<li>הפעל את פולר מחט כדי ליצור את המחט הנכון. חזור על צורך ייצור מחטים מרובים. הערה: ניתן לאחסן מחטים משך על-ידי הצבתם לתוך צלחת פטרי המכילות שבמקביל מספר גלילים מחימר של התיקים מסחרי.</li>
	<li>מסגרת משופעת של מחט על-ידי נגיעה במקצת את הטיפ יהלומים מחוספסים לצלחת בסביבות 10 s ב- 25 ° C (איור 2- iii). הערה: המחטים הזרקת תועלת שיפוע באמצעות קידום כניסתו העוברים עם נזק מינימלי תוך שיפור בו זמנית את הזרימה של חברי ההנהלה דרך המחט.</li>
</ol>
4. העובר Microinjection
<ol>
	<li>להכין לתערובת הזרקת המורכב של הגנום השינוי ריאגנטים (למשל, transposon + עוזר transposase, או CRIPSR ריאגנטים, וכו '.), ולשמור אותו בקרח.</li>
	<li>לטעון את המחט הזרקה עם 2 µL של הזרקת תערובת באמצעות טיפים microloader. הערה: התערובת הזרקת הפגינו בפרוטוקול מורכב יחיד-מדריך RNA (sgRNA) (s), חלבון רקומביננטי Cas9 מעורב ב H2O.</li>
	<li>מקם את השקופית זכוכית עם העוברים שורות לבמה של מיקרוסקופ המתחם.</li>
	<li>הכנס היטב את המחט בקצה האחורי של העובר עם זווית אנכי של 25-35 מעלות.</li></ol>להזריק pL 1-5 של הזרקת תערובת (בסביבות 2-10% נפח של העובר) וודא כי העובר מופיע להתנפח מעט כמו התערובת מוזרק לתוכו (איור 2- iv). הערה: אם התערובת הזרקה מדי מוזרק העובר זה ייתכן פרץ לסילוק הציטופלסמה של העובר. בנוסף, באופן לא תקין משופע או שבור מחטים עם גדול מדי של פתיחה עלולים גם הם לגרום קרע העובר.<ol>
		<li>נסה מחדש מסגרת משופעת מחטים אם סתימת מתרחשת. הציטופלסמה של vitripennis (ש ע) העוברים הוא באופן חריג צמיגה, דביק, מה שמוביל המחט תכופים סתימת (1/25 זריקות). הערה: חשוב לשמור את העוברים לחות במהלך תקופת הזרקת בהוספת מים מיוננים שימוש במכחול באופן קבוע. כמות המים על המברשת היא המפתח כדי לנוע עוברי ליישר בקלות. מדי מים תוצאות עוברי מים צפים מעט מדי גורם להם קשה לנוע.</li>
		<li>להזריק ~ 20-40 ביצים בבת אחת (אמור לקחת בערך 10 דקות), אז תפסיק. להעביר את הביצים מוזרק באמצעות מברשת צבע רטוב על-ידי נגיעה בקלילות את הביצים מוזרק, למקם אותם לתוך מחשב מארח. ואז להמשיך להזריק שוב באמצעות טרי שזה עתה זיון אצווה של ביצים (&#62; הישן 1 h). הערה: באופן אידיאלי פרוטוקול זה הוא היעיל ביותר אם אדם אחד ללא הרף איסוף בתור ביצים, בעוד אדם אחר הוא הזרקת רכיבי השינוי של הגנום משתילים עוברי מוזרק אל המחשב המארח הגלמים.</li>
	</ol>
	

5. משתילים Injected G0 vitripennis (ש ע) העוברים על גבי Pre-stung מארח
<ol>
	<li>בזהירות המקום העוברים0 גרם מוזרק אל בעבר נעקץ ס bullata גלמי (איור 2- vi) באמצעות מברשת צבע רטוב לאחר microinjection. הערה: הגלמים מארח המשמש לאיסוף העוברים על microinjection יעבוד למטרה זו. בנוסף, למרות מאמץ משמעותי, יש כיום אין מזון מלאכותי זמין זה יכול להיות בשימוש22.<ol>
		<li>הצב עוברי עד 40 מוזרק אחת בכל פעם על גבי מארח נעקץ מראש אחד כדי למנוע תחרות, צפיפות זחל. הערה: הזרקת יגרום נזק העוברים; השתלת רשלנית של העוברים מוזרק אל הגלמים המארח יכול לסחוט את הרכיב מוזרק או החלמון, להוביל למותו של העוברים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>למקם את הגלמים מארח צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן, דגירה אותם 25 ° c עם בערך 70% לחות עד עוברי מוזרק בוקעות (בערך 1-2 ימים) (איור 2- vii). הערה: חשוב, המארחים יכול להישאר עם קלופים puparium, את vitripennis (ש ע) ביצים יתפתחו בדרך כלל כל עוד הם מודגרת בתוך תא humidified (צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן) כדי למנוע לייבוש. מספיקה המקננת בטמפרטורת החדר, עם לחות מן הכדורים כותנה לחה, במקרה שלא ניתן לשלוט לחות.</li>
	<li>העברת הגלמים מארח לתוך צלחת פטרי חדש ב 70% לחות ו- 25°C לאחר G0 עוברי הפתח.<ol>
		<li>לנטר את המחשב המארח הגלמים וזחלים מוזרק G0 מדי יום. אם הגלמים המארח יש ריח רע, להעביר את הזחלים מוזרק הגלמים מארח בריאה חדשה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. הקרנת עבור שינויים הגנום
<ol>
	<li>הסר כל גלמי vitripennis ש המארח באמצעות מברשת הצבע בסדר או העובר פיק. שהוחדר G0 הזחלים צריך pupate בסביבות 8 ימים שלאחר ההזרקה.</li>
	<li>המקום כל גולם שהוסר לתוך בקבוקון זכוכית מבודדת מחובר עם כותנה ולאפשר להם לצאת כמו G0 מבוגרים, המבטיח כי הנקבות המקווקו תהיה בתולה אשר יסייע עם צלבים גנטי במורד הזרם. הערה: נקבות ניתן למיין מן הזכרים לפי אורך הזרוע: נקבות יש כנפיים יותר אשר להרחיב מעבר לפרופיל הגוף כשמלאו בצד. ניתן להציב כל הגלמים הנשי microinjected יחד לתוך בקבוקון פקוק, אותו הדבר חל על גלמי זכרים.</li>
	<li>מסך G0 יחידים, לאחר וגיחתו על-ידי ה-PCR גם או ויזואלית (אם לשבש את פעולת הגן פנוטיפי). לדוגמה, אם CRISPR משמש ליצירת מחיקות בגן נתון הגן שיבשו מקנה הפנוטיפ גלויים, ואז למיין ולשמור אנשים עם גירסת מוטציה פנוטיפ המושפע (איור 2- viii)21. אם, לעומת זאת, הגן המושפעת מקודד עבור הפנוטיפ גלויים, כגון מוטציה של ג'ין חיוני, לבצע ערכה המעבר (קרוס G0 זכר עם נקבה פראי סוג או קרוס G0 נקבה עם זכר פראי סוג) כדי לשחזר לבין מסך עבור מוטציות heritable דרך assaying קטלני או עקרות. הערה: דומה melanogaster ד, מבוגרים vitripennis ש יכול להיות מרותק למיטה על ידי חשיפה CO2 המאפשרות מניפולציה פשוטה. יתר על כן, נקבות unmated יהיה להצמיח האפרוחים זכר הפלואידי 100%, אז לכן שנקבה unmated מוטציה יכולים להצמיח מספר גדול של הזכרים מוטציה יכול לשמש לצורך ניתוח מאוחר יותר. הערה: מוטציות בגנים חיוניים יהיה צורך להיות כל הזמן על ידי הזדווגות ששרד G0 מוזרק נקבות (ככל הנראה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור מוטציה) זכרים פראי סוג; במקרה ספציפי זה, מחצית הוא צאצא זכר1 G צריך למות בגלל הורשת המוטציה קטלני, בעוד חצי צאצאים נקבה1 G יהיו נשאים של שוק.</li>
	<li>Outcross G0 מבוגרים על מסך G רומא1 עבור הוספות transgene באמצעות סמנים transgenesis אם המטרה היא transgenesis. כעת transgenesis נשאר להדגים ב vitripennis ש.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivers, D. B., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+of+the+flesh+fly,+Sarcophaga+bullata,+envenomated+by+the+pupal+ectoparasitoid,+Nasonia+vitripennis.">Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis.</a> J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).</li><li>Whiting, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+the+Parasitic+Wasp+Mormoniella+vitripennis+[=Nasonia+brevicornis]+(Walker).">The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker).</a> Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).</li><li>Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterium+targets+maternally+inherited+centrosomes+to+kill+males+in+Nasonia.">A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia.</a> Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).</li><li>Hurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-Killing+Bacteria+in+Insects:+Mechanisms,+Incidence,+and+Implications.">Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications.</a> Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Sci Rep. 7, 42551 (2017).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li><li>Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+that+enhances+its+transmission+by+eliminating+the+paternal+genome.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome.</a> Science. 240 (4851), 512-514 (1988).</li><li>Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+Proteins+of+the+Parasitoid+Wasp+Nasonia+vitripennis:+Recent+Discovery+of+an+Untapped+Pharmacopee.">Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee.</a> Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).</li><li>de Graaf, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+venom+composition+of+the+ectoparasitoid+wasp+Nasonia+vitripennis+from+bioinformatic+and+proteomic+studies.">Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies.</a> Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Grillenberger, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+structure+of+natural+Nasonia+vitripennis+populations:+validating+assumptions+of+sex-ratio+theory.">Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory.</a> Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).</li><li>Pultz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+zygotic+hunchback+in+patterning+the+Nasonia+embryo.">A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo.</a> Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).</li><li>Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+maternal+orthodenticle+patterns+anterior+and+posterior+in+the+long+germ+wasp+Nasonia.">Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia.</a> Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).</li><li>Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+tailless+in+the+long+germ+wasp+Nasonia+vitripennis.">Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis.</a> Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genes+Uniquely+Expressed+in+the+Germ-Line+Tissues+of+the+Jewel+Wasp+Nasonia+vitripennis.">Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis.</a> G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+infection-induced+transcriptome+of+Nasonia+vitripennis+reveals+a+preponderance+of+taxonomically-restricted+immune+genes.">Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes.</a> PloS one. 8 (12), e83984 (2013).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Nasonia+(parasitoid+wasp).">Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp).</a> Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microinjection+protocol+for+the+parasitoid+Nasonia+vitripennis.">Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis.</a> Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

רצף האחרונות של הגנום vitripennis ש יש שיחרר צורך חשוב כלים לאפיין באופן פונקציונלי הגנים לא ידוע בתוך זה מינים23. מערכת CRISPR-Cas9, וכלים רבים אחרים ג'ין העריכה, הוכיחו להיות יקר בחקירת פונקציות ג'ין עבור מספר אורגניזמים24. עם זאת, כדי ליצור מוטציות heritable, כלים אלה דורשים ביצוע העובר microinjections. לכן, הפגינו הנה טכניקה חזותית מפורטת כולל מספר חידושים המאפשרים יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections.
בסך הכל, טכניקה זו מפורט מציע מספר חידושים משמעותיים, לגבי שיטות קיימות23, המאפשרות יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections. לדוגמה, כדי להקל על האוסף מהירה של העוברים, כלי ההטלה (קצף פקק) הוא נוצרים ונמצאים בשימוש כדי להגביל את הנחת לחלוטין לקצה האחורי של המחשב המארח (איור 1), אשר מאוד מקל אוסף של רבים העוברים בתוך ביצה תקופה קצרה של זמן. שיטות לגידול צרעה מושבות עם מספרים גדולים כדי לאסוף מספר רב יותר של ביצים משופרת גם ומוגדר. בנוסף, כדי להאיץ עובר יישור, מפותחת התקן יישור העובר, מה שמאפשר עבור עוברי ביעילות מיושר, מוזרק מבלי להשתמש דו-צדדית קלטת דביק כדי לאבטח את העוברים במקום (איור 3).
יתר על כן, הוא נמצא כי על ידי שמירה על לחות עם מים העוברים במהלך ההזרקה ולא desiccating את העוברים או מכסה אותם עם שמן שיפרה שיעורי ההישרדות. בנוסף, נבדקים מספר סוגי זכוכית נימי, נקבעים פרמטרים כדי לבנות את המחטים מושלם עבור vitripennis (ש ע) microinjection (טבלה 1, איור 4). יתר על כן, microinjection הבאות, הישרדות העובר תעריפי אפשרות להגדיל באופן משמעותי עקב המקננת ביצים מוזרק המארחים מראש נעקץ להציב בתאי לחה (70%). חידושים אלה מאפשרים שגרה microinjection יותר יעילה ומצליחה vitripennis ש.
ניתן לבצע שינויים מזעריים במונחים של מכשיר הזרקה, והגידול הליכים פרוטוקול זה, בהתאם להעדפות משתמש. עם זאת, מספר צעדים קריטיים יהיה חיוני ליצירת מוטציות בהצלחה ב- vitripennis (ש ע). לדוגמה, עובד מהר. כך הם עוברי מוזרק &#62; העתיקה h 1, ומבטיחה כי מחטים הזרקת אינם חדים מספיק. למזער את הנזק העובר שנינו נהיה חיוני. בעוד פרוטוקול זה צריך להיות יעיל ליצירת מוטציות בגנים רבים (אם לא כולם), מגבלה אחת גדולה היא הדרישה CRIPSR/Cas9 למטרה רצף פאם (הגולה) אשר יכתיב את רצף היעד.
לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקה זו משופרת כדי ליצור סוגים רבים של הגנום שינויים, כגון מוטציות, מחיקות, ואולי אפילו הוספות באמצעות טכנולוגיות CRIPSR/Cas921, או אפילו transgene הוספות ליצירת הטרנסגניים (ש ע) vitripennis, אשר צריך להאיץ באופן משמעותי הפונקציונלית במחקר האורגניזם הזה.

צרעה תכשיט, (ש ע) vitripennis, הוא אחד מארבעת המינים בתוך הסוג של Nasonia כי הם ectoparasitoids של בשר לאכול זבובים כגון Sarcophaga bullata1. עקב תקופות שלהם מהיר-דורי, קלות לגידול של המעבדה, ומגוון רחב של תכונות ביולוגיות חשוב וייחודי, ש vitripennis היה מוקד לפיתוח של כלי ניסיוני מרובים הנמצאים במודל המסורתי אורגניזמים . לדוגמה, תכונות מסוימות ביולוגי ייחודי כוללים מערכת רבייה האפלו-דיפלואידי2, יחסים עם טפילים חיידקים ותעשיה3,4supernumary (B) כרומוזום5,6 ,7. יחדיו, אלה גורמים vitripennis (ש ע) מערכת ניסויית חשוב עבור ניסויים שמטרתם הבהרת ההיבטים הסלולר המולקולריים של תהליכים אלה, בנוסף אחרים כולל ארס הייצור8, 9, נחישות סקס10,11, ו האבולוציה והתפתחות של ציר דפוס היווצרות12,13,14. יתר על כן, ערכת הכלים גנטי לחקר הביולוגיה של N. vitripennis גדל באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, או אז, עם הרצף של הגנום ברזולוציה גבוהה15, ביטוי גנים מספר מחקרים16,17,18, ו היכולת לשבש באופן פונקציונלי ביטוי גנים להסתמך על התערבות RNA (RNAi)19,20, אשר ביחד יש משופרים ללקוחות שלנו, יכולות להופיע גנטיקה הפוך את האורגניזם הזה.
למרות הפיתוחים המדעיים החשובים, ומקורות המורחב של האורגניזם רבים, החל הידע הנוכחי רק קבוצה אחת ביצעה בהצלחה microinjections עובריים ליצירת שינויים הגנום heritable21. זאת בעיקר בשל הקשיים של עבודה עם עוברי של vitripennis (ש ע) כפי שהם די קטן, להיות ~2/3 בגודל של עוברי דרוזופילה melanogaster , שהופך אותם בדרך כלל קשה לתמרן ושבירה. בנוסף, vitripennis (ש ע) הנקבות להפקיד את ביציהם לגלמים זבוב מראש נעקץ, שבתוכה מתרחשת מכלול של מופרה, זחל, ופיתוח הגולמי. לכן, עבור microinjections מוצלח, שלב טרום blastoderm, העוברים חייב להיות ביעילות שנאסף מארח הגלמים, במהירות microinjected, מושתלים מיד בחזרה לתוך מארחיהם לפיתוח. הפעולות הבאות דורשות דיוק ומיומנות כדי למנוע נזק העוברים microinjected, או המארחים הגולמי, ביצוע הטכניקה מאתגר במיוחד. על אף האמור, יש פרוטוקול קצר אחד, שפורסם לפני יותר מעשור המתארת vitripennis (ש ע) העובר microinjection22. עם זאת, הליך זה דורש העוברים צבען להיות desiccated, היא משתמשת סרט דביק כדי לעגן את הביצים על microinjection, לא כולל הדגמה ויזואלית של הטכניקה. לכן, המתוארים כאן הוא פרוטוקול מעודכן, מתוקנת, לרבות הליך חזותי, המפרט את פרוטוקול צעד אחר צעד משופרת עבור העובר vitripennis ש microinjections זה יכולה להיות מלווה בכל מעבדה בסיסיות ליצירת heritable הגנום שינוי מודל חשוב החרק.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Glass Test Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Flesh fly pupae, &lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Can also use Borosilicate or Quartz</td></tr><tr><td>Identi-Plugs</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>Foam plugs</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>For glueing coverslip onto microscope slide</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forcep</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

embryo microinjection and transplantation technique for nasonia vitripennis genome manipulation

הצרעה תכשיט Nasonia vitripennis התפתחה מערכת מודל יעיל לחקר תהליכים כולל קביעת מין, זוויג האפלו-דיפלואידי, ארס סינתזה של אינטראקציות מארח-ונאבו, בין היתר. מגבלה עיקרית של עבודה עם האורגניזם הוא המחסור פרוטוקולים יעיל כדי לבצע שינויים הגנום מכוונת. חלק חשוב של שינוי הגנום הוא משלוח של עריכת ריאגנטים, לרבות מולקולות CRISPR/Cas9, העוברים דרך microinjection. בעוד microinjection וותיקה אורגניזמים דגם רבים, טכניקה זו היא מאתגרת במיוחד כדי לבצע ב- vitripennis (ש ע) בעיקר בשל גודלו העובר קטן, ואת העובדה כי התפתחות מתרחשת לחלוטין בהישג זבוב parasitized גולם. ההליך הבא מתגבר על אלה אתגרים משמעותיים תוך הפגנת הליך יעיל, חזותי להסרת ביעילות צרעה העוברים מן parasitized מארח הגלמים, microinjecting אותם, בזהירות משתילים אותם חזרה אל המחשב המארח עבור המשך והשלמה של פיתוח. פרוטוקול זה יהיה בתוקף לשפר את היכולת של קבוצות מחקר כדי לבצע שינויים מתקדמים הגנום ב האורגניזם הזה.

פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורט המושבה לגידול, אוסף blastoderm מראש העובר, יישור, microinjection של השתלת הבאים לאחר ההזרקה, יכול לשמש עבור הנדסה הגנום יעיל ב- vitripennis ש. כפי שמוצג באיור2, רצף השלבים עבור microinjection מוצלח לתוך vitripennis ש כללי כוללים: (i) המתיר מבוגרים זכרים ונקבות להזדווג (~ 4 ימים), (ii) אספקת גלמי לטוס טרייה המארח (S. bullata) ממוקם הכנס קצף ששונה נקבות ובסיומה, המאפשרות ההטלה (~ 45 min), (iii) בזהירות פילינג משם את הקוטיקולה הגלמים המארח parasitized כדי לחשוף ולאסוף שלב טרום blastoderm צרעה עוברי (~ 15 דקות), יישור (iv) שנאספו עוברי (~ 15 דקות), (v) רכיבי השינוי הגנום microinjecting לתוך עוברי (~ 15 דקות), העוברים מוזרק מהצבת בקפידה (vi) חזרה אל המארחים נעקץ מראש כדי לאפשר פיתוח תקין (~ 15 דקות), ו (vii) מניעת התייבשות של המחשב המארח/העובר מוזרק על ידי העברת אותם לתא humidified עם בערך 70% לחות יחסית (~ 15 דקות). המארחים parasitized ואז מודגרת למשך בערך 14 ימים כדי לאפשר את התפתחות מלאה של עוברי vitripennis ש . ברגע מוזרק, מבוגרים מגיחים המארח (השמיני), לבודד, חבר, לבין מסך אותם בנפרד לנוכחות של מוטציות הצפוי.
חדירה יעיל מחט, microinjection לתוך vitripennis ש עוברי, מספר סוגים של מחטים נימי זכוכית עם נימה כולל סוגי הקוורץ, aluminosilicate ובורוסיליקט נבדקים. הוא נמצא כי האיכות של המחט הוא קריטי עבור הימנעות שבירה/סתימת במהלך ההזרקה, להשגת שיעור גבוה של שני יעילות הישרדות וטרנספורמציה של העובר. עבור כל סוג הזכוכית, פרוטוקול יעיל פותחה כדי למשוך מחטים כדי יש הרצוי תת-עורית דמוי זמן טיפ יעיל עבור vitripennis ש microinjection העובר באמצעות אלו שלוחצים micropipette שונים (P-1000, ו P-2000) (טבלה 1 איור 4).
כדי למטב את ההליך, נמדדים שיעורי ההישרדות לאחר ההזרקה של כמויות משתנות של הגנום שינוי רכיבים. הגנום שינוי הרכיבים המשמשים כאן היו מעורבים RNAs הוראות Cas9 חלבון עבור גנום בתיווך CRISPR עריכה, אשר היו הפגינו בעבר לעבוד גם ב vitripennis (ש ע)21. בדומה למה שהיה קודם לכן דיווח, כאן פילוח sgRNA הגן כינאבאר ותחתית מסונתז. על ידי מיקוד ומפריעה גן זה, החלפת פנוטיפי הניתנות לזיהוי בקלות הוא לראות את צבע העיניים של19,האורגניזם21. תערובת הזרקת המשלבת בתוכה מגוון של ריכוזים של sgRNA (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) עם חלבון Cas9 (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) נוצר, מוזרק העוברים מסוג הפרוע vitripennis ש. שיעור ההישרדות של עוברי מוזרק הוא נמצא כדי להיות תלוי במינון (טבלה 2)21. ריכוז מוגבר של sgRNA ו- Cas9 חלבון להוביל שיעורי ההישרדות ירד (טבלה 2), אולי בגלל תופעות מוספים את המטרה. לחות גבוהה (~ 70%) נמצא גם חשוב להישרדות העובר לאחר ההשתלה למארחים, כמו לחות נמוכה (~ 10%), גרמו 100% מוות כל העוברים מוזרק.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
איור 1 . הכנת הגלמים המארח (S. bullata) עבור vitripennis ש העובר ההטלה. (א) יאנג, גלמי bullata ס הישן. גלמים מבוגרת יש לציפורן כהה יותר ואילו הצעיר גלמי יש גוון אדמדם יותר כדי לציפורן שלהם. הגלמים הצעירים עדיפים למקסם ההטלה. ניתן גם להבחין וקצה אחורי קדמי של הגלמים על-ידי "דמוי מכתש פתיחת בקצה האחורי, ואילו בקצה הקדמי מגיע לנקודה מעוגל. (B) המארח (S. bullata) גולם לקראת ההטלה העובר ש vitripennis . הוספת הגלמים מארח לתוך פקק קצף כי יש לו את הגלמים בגודל חור בנה. יש את הצד האחורי של הפנים הגלמים מארח בתוך התקע בעוד 0.2 ס מ בקצה הקדמי חשוף כדי לאפשר ריכוז מרבי של הטלה לתוך האזור הקדמי. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
איור 2 . ציר זמן עבור יצירת vitripennis ש מוטציות מאת microinjection. ציר הזמן של אוסף העובר (ש ע) vitripennis , microinjection CRISPR/Cas9 ושגרות שלאחר ההזרקה. (ש ע) vitripennis מבוגרים הורשו להזדווג בהעדר אתר ההטלה של ארבעה ימים (אני). טרי, זבוב הבשר מארח הגלמים, ס bullata, בתוך פקק קצף באשר רק לחשוף 0.5 ס מ של הסוף האחורי, הבאים, הוצגה בפני הנקבות gravid למשך 45 דקות כדי לאפשר parasitization (ii). במקביל הוכנו הזרקת חומרים כולל מחטים microinjection ורכיבים CRISPR/Cas9 (iii). העוברים היו הנאסף מהמחשב המארח (iv), מיושר (v), מוזרק עם רכיבים CRISPR/Cas9 (vi). העוברים מוזרק היו בקפידה להחזיר את מארח נעקץ מראש (vii), מודגרות עד מפותחת (14 ימים) (השמיני). כאשר המבוגרים הגיח, מוטציות הוקרנו על פנוטיפים של מוטציות CRISPR/Cas9 המושרה הצפוי הגן היעד (ix). ההליך כולו אורכת בדרך כלל 19 ימים כדי להשלים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
איור 3 . שקופיות מיקרוסקופ ששונה לצורך התאמת עוברי. (א) א coverslip. (B) של שקופיות מיקרוסקופ. (C) התקן יישור של העובר.Coverslip יכול להיות דבוק לשקופית מיקרוסקופ כדי לשמש קו עוברי להזרקה. המטרה של coverslip היא לפעול כמו קצה כדי לאפשר טיפול קל, הציפוי הפנימי של העוברים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
איור 4 . הכנה מחט ההזרקה. (א) דוגמאות aluminosilicate טוב ורע זכוכית מחטים. (B) קצות המחט משופע unbeveled כראוי משופע, גרוע. Aluminosilicate זכוכית צינורות קפילר הוסרו על-ידי שימוש של פולר micropipette. העצות המחט המיוצר היו אז פתח בעדינות ומעודן באמצעות של beveler. המחט המשופעים טוב יש קצה חד מאד, המחט המשופעים רע יש קצה קהה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>סוג זכוכית נימי</td>
			<td>מודל פולר המחט סאטר</td>
			<td>חום</td>
			<td>פילמנט</td>
			<td>מהירות</td>
			<td>עיכוב</td>
			<td>משוך</td>
			<td>לחץ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קוורץ</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בורוסיליקט</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. הגדרות עבור מחט פולר. הערה: ההגדרה פולר המחט להשתנות מכונת מכונת אז כל המעבדה יהיה עליך למטב את הגדרות פולר משלהם המחט. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">סה כ עוברי</td>
			<td>השתלת (10% לחות)</td>
			<td colspan="4">השתלת (70% לחות)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>הזחלים ניצולים</td>
			<td>הזחלים ניצולים</td>
			<td colspan="3">ניצולים מבוגרים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סה כ (%)</td>
			<td>סה כ (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>סה כ (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אין הזרקה</td>
			<td>אין הזרקה</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים</td>
			<td>מים</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2. הזרקת והשתלות שאירים מוטגנזה מכוונת וקצבי בהתבסס על זריקות של ריכוזים שונים של sgRNA ושל Cas9. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation at JoVE.com

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

12.2K Views.  University of California, Riverside. Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

Video: Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 טרנסגנזה של עובר בתיווך אינטגראז בדרוזופילה

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של מיקרו-הזרקה לעובר עבור טרנסגנזה בדרוזופילה

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioengineering

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9