Notre recherche se concentre sur l’évaluation de la diversité fonctionnelle des cellules CAR-T en encapsulant des cellules CAR-T effectrices uniques avec des cellules cibles afin de mieux comprendre leur potentiel cytotoxique au niveau de la cellule unique. Les tests de cytotoxicité actuels sont limités car ils sont souvent effectués en vrac. Cela ne tient pas compte des différences entre les cellules CAR-T individuelles et ne permet pas d’identifier des sous-populations distinctes ayant des réponses variables aux cibles.
Notre technologie permet des tests de destruction cellulaire multiplex dans un format de cellule unique à l’aide de cytomètres en flux standard et d’ordres de cellules. Cela donne des résultats plus précis que les protocoles en vrac, car il n’y a pas d’interférences des cellules voisines. Nous espérons que ce type de recherche nous permettra, ainsi qu’à d’autres scientifiques, de mieux examiner les détails de nos CAR et leur fonctionnement au niveau de la cellule unique.
Pour commencer, diluez des solutions mères de deux colorants fluorescents dans un rapport de 1:5 000 dans le PBS de Dulbecco. Transférez les cellules dans des tubes séparés de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 300 g pendant cinq minutes.
Retirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles de la cellule effectrice dans la solution de travail du colorant fluorescent violet. Remettez en suspension les pastilles de cellules cibles dans la solution de travail du colorant fluorescent rouge lointain. Incuber les cellules colorées pendant 20 minutes dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes pour les granuler. Remettez en suspension les granulés de cellules dans 15 millilitres de milieu RPMI 1640 complet pour les laver. Laver et centrifuger à nouveau.
Retirez ensuite le surnageant et remettez en suspension les pastilles de cellules effectrices dans 225 microlitres de milieu RPMI 1640 complet et les pastilles de cellules cibles dans 450 microlitres du même milieu. Ajoutez 30 microlitres d’un milieu à gradient aux suspensions de cellules effectrices et 60 microlitres aux suspensions de cellules cibles. Bien mélanger la solution mère de milieu dégradé avant le pipetage.
Ensuite, prédiluez le stock de substrat Granzyme B avec un milieu RPMI 1640 complet. Pipeter la solution mère d’iodure de péridium et le substrat dilué de Granzyme B vers les suspensions de cellules effectrices et les suspensions de cellules cibles. Ensuite, pipetez pour bien mélanger les solutions.
Pour encapsuler les cellules, préchauffez la cartouche d’encapsulation et la solution stabilisante à température ambiante. Ajouter un milieu RPMI 1640 complet : 33 % de solution stabilisante pour cellules et 10 % de gradient. Et mélangez-les pour préparer un bouillon de milieu extérieur.
Pour chaque échantillon d’encapsulation, mélangez 65 microlitres de suspension de cellules effectrices préparée avec 65 microlitres de suspension de cellules cibles préparées dans un tube de 1,5 millilitre. Remettez bien les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Chargez les puits indiqués de la cartouche d’encapsulation avec des réactifs dans l’ordre indiqué.
Reese suspend bien les cellules avec une pipette juste avant le chargement. Scellez soigneusement le joint sur la cartouche. Transférez la cartouche dans le dispositif microfluidique, puis lancez l’encapsulation conformément au manuel d’utilisation.
Une fois l’exécution terminée, retirez la cartouche et récoltez les gouttelettes du puits D en les mettant à nouveau en suspension dans le milieu de recouvrement et en les transférant dans un tube d’ADN de deux millilitres à faible liaison avec un couvercle. Lavez bien D avec le milieu extérieur restant du puits A pour recueillir les gouttelettes restantes. Lorsque les gouttelettes se sont sédimentées dans les tubes collecteurs, confirmer deux phases nettement distinctes dans les tubes avant l’examen microscopique.
Remplissez environ un tiers d’une pointe de pipette de 10 microlitres avec des gouttelettes provenant de la surface de la couche de gouttelettes. Remplissez ensuite les deux tiers restants de la pointe de la pipette avec le support de recouvrement. Chargez immédiatement l’échantillon sur une lame de verre à huit chambres.
Examinez les gouttelettes au microscope à un grossissement de 4x et 20x pour confirmer le chargement des gouttelettes avec les cellules. Pour l’incubation, utilisez une aiguille de seringue de calibre 21 pour percer soigneusement le couvercle du nombre requis de tubes de deux millilitres d’ADN à faible liaison. Ajouter un millilitre de milieu extérieur dans chaque tube d’incubation.
Remettre en suspension les gouttelettes générées dans le milieu de recouvrement et diviser chaque production en trois tubes d’incubation préparés. Placez les tubes à la verticale dans l’incubateur pendant deux, quatre ou six heures d’incubation après la génération de gouttelettes. Après l’incubation, transférez un petit nombre de gouttelettes sur une lame de microscope.
Analysez les gouttelettes par microscopie à fond clair et à fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence standard avec une configuration laser et un filtre appropriés. Remettez en suspension chaque échantillon de gouttelettes dans le milieu de superposition. Transférez les échantillons remis en suspension dans des tubes FAC de cinq millilitres.
Analysez les gouttelettes à l’aide d’un cytomètre en flux standard. Enregistrez les signaux de hauteur d’intensité pour la diffusion vers l’avant, la diffusion latérale et les fluorophores examinés. Lavez le cytomètre en flux à travers l’orifice d’injection de l’échantillon après chaque série d’acquisitions de gouttelettes à l’aide de solutions standard de nettoyage et de rinçage.
Les cellules CAR-T ont été enrichies avec succès à une pureté de plus de 98 % pour les deux donneurs à l’aide de billes magnétiques anti-NGFR et leur rapport CD4-CD8 a été quantifié à 0,73 avec un phénotype naïf de mémoire observé. Des lymphocytes T non transduits ont été utilisés comme témoins dans l’expérience. La microscopie à fluorescence après quatre heures d’incubation a mis en évidence une sécrétion de Granzyme B dans des gouttelettes avec des cellules JeKo-1 coencapsulées avec des cellules CAR-T, alors qu’aucune sécrétion n’a été détectée avec des cellules T non transduites.
La cytométrie en flux a permis d’identifier des populations de gouttelettes distinctes en fonction des types de cellules encapsulées, confirmant que la sécrétion prononcée de Granzyme B et l’activité cytotoxique se produisaient dans les gouttelettes contenant des cellules CAR-T et des cellules cibles JeKo-1. La sécrétion de Granzyme B et la destruction des cellules cibles par les cellules CAR-T ont montré une augmentation dépendante du temps, avec plus de 30 % de cellules CAR-T sécrétant Granzyme B après six heures et plus de 20 % des cellules CAR-T tuant les cellules cibles, comme l’indique la positivité de l’iodure de propidium.
