Name: generation of transgenic hydra by embryo microinjection
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
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Este trabajo fue apoyado por una Harold y Leila Y. Mathers G. Premio a HL y una subvención del NIH (R24 GM080527) a RESCEJ era un Postdoctoral Fellow NRSA (NIH F32GM9037222) y actualmente es apoyado por un Premio al Desarrollo Científico Mentored Investigación de la Nacional Instituto del Envejecimiento (K01AG04435). Nos gustaría agradecer a los revisores por sus valiosos comentarios.

1 Preparación de ADN plásmido, agujas, y platos de inyección <ol><li> Preparar el ADN de plásmido usando un kit Maxi de alta velocidad o Midi y se concentra el ADN a 2,5 mg / ml utilizando la precipitación con etanol. El sedimento de ADN se debe disolver en agua desionizada libre de nucleasa. Almacene el ADN en 10-20 alícuotas a -20 ° C. (Véase el cuadro 1 complementario para obtener una lista de vectores disponibles) </li><li> Hacer un plato de inyección utilizando agarosa para construir un canal para la celebración de los embriones en una placa de 100 x 15 mm de Petri. <ol><li> Colocar un portaobjetos de microscopio de vidrio 75 x 50 en una placa de 100 x 15 mm Petri en un ángulo. Vierta aproximadamente 50 ml de 2% de agarosa fundido en un medio de Hydra 24 en la placa de Petri. Alternativamente, se vierte la agarosa en el plato primero y flotar un &quot;Mold Microinyección Fish&quot; en la parte superior. </li><li> Después de la agarosa se ha solidificado, retirar el portaobjetos de vidrio o el molde. Si se ha utilizado un portaobjetos de vidrio, cortar el exceso de agarosa con un bla de afeitarde para formar una pared. Verter medio Hydra en el plato y utilizar inmediatamente o almacenarlo a 4 ° C hasta que se necesite. Nota: los platos de inyección pueden ser reutilizados si se almacenan a 4 ° C entre usos. </li></ol></li><li> Tire las agujas de capilares de vidrio borosilicato con un filamento en el extractor de micropipeta usando las siguientes condiciones: calor 525, tire 75, velocidad 100, tiempo 50. Tienda las agujas de comprimirlos en una estrecha franja de tierra batida en un plato de Petri de manera que sean mantenida en paralelo a la parte inferior del plato. </li><li> Para preparar la solución de inyección, combinar 3 l de solución de ADN de plásmido de 2,5 mg / ml con 2 l de 10% de fenol rojo. Vortex la solución brevemente y luego girar por 10 min a velocidad máxima en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden obstruir la aguja. </li><li> Bajo un microscopio de disección, corte la aguja unos pocos milímetros de la punta con fórceps para crear una pequeña abertura. Nota: Hay una cierta flexibilidad en el tamaño adecuado de la aperturaing porque la presión se puede ajustar en el paso 3.3 para acomodar esta variación. </li><li> Coloque la placa de Petri de modo que se mantiene la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Cargar la aguja con aproximadamente 0,5 l de solución de inyección con la pipeta el líquido en el extremo posterior de la aguja. Permitir que la acción capilar para tirar de la solución en la punta de la aguja. </li></ol> 2 Preparación de embriones para inyección <ol><li> Sobre una base diaria escanear el cultivo de la cepa Hydra AEP para los pólipos producen huevos. Reunir estos pólipos y déjelos a un lado en una placa de cultivo separado. Observar estos pólipos cada pocas horas durante el día para controlar el progreso de la formación del huevo. Cuando los huevos se rompen a través del ectodermo y se sientan en un anillo de células ectodérmicas retraídos que están listos para inyección 25. Coloque estos pólipos en un plato con varios Hydra que tienen testículos durante al menos 1 hora antes de la inyección para permitir la fertilización. Hydra &lt;/ Em&gt; machos lanzará esperma sin ninguna manipulación especial. </li><li> Si las hembras se encuentran en la colonia AEP con los huevos completamente formados, que son aproximadamente 400 micras de diámetro 25, o de 1 a embriones en estadio de 8 células, también recoger estos para inyección. Inmediatamente inyectar embriones que han comenzado escisión. Nota: No es posible establecer la diferencia entre los huevos completamente formadas y cigotos unicelulares, por lo tanto estas deben ser incubadas con los machos antes de la inyección. </li><li> Antes de la inyección, eliminar la mayor parte del tejido parental encima y por debajo del embrión usando un escalpelo con una cuchilla # 15. Dejar sólo el embrión con un pequeño trozo de la columna cuerpo adjunto, que se utiliza para manipular el embrión con pinzas si es necesario. Nota: El tejido que se diseca lejos del embrión regenerará y debe ser guardado para asegurar que las mujeres permanecen en la colonia Hydra. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, mover el plato de embriones para inyección, disponiéndolos en paralelo a la pared de laa través de agarosa. </li></ol> 3. microinyección de ADN plásmido <ol><li> Monte el microinyector en un soporte magnético que se sienta en una placa de hierro. Montar el soporte de inyección, que es la parte de la microinyector que mantiene la aguja, en un micromanipulador joystick. Monte el manipulador joystick a la plancha de hierro, con un soporte magnético. Coloque esta todo el conjunto-en el lado derecho de un microscopio de disección y colocar el soporte de inyección de modo que sea visible en el campo de observación. </li><li> Coloque el plato de la inyección con embriones bajo el microscopio de disección, orientada de tal manera que la pared vertical de la cubeta de agarosa está a la izquierda. Insertar la aguja en el soporte de inyección y bajar la punta de la aguja en el medio Hydra en el plato. </li><li> Girar lentamente el pomo de la jeringa en la dirección de las agujas del reloj hasta que el aceite mineral se llena la parte superior de la aguja y un flujo constante de solución de inyección se observa que sale de la aguja en el hidrun medio. Si la corriente es demasiado fuerte, reduzca la presión girando la perilla a la izquierda. Practicar este paso para obtener de forma rutinaria una presión adecuada, que depende del tamaño de la abertura de la aguja (es decir, cómo se recorta la aguja en el paso 1.5). Nota: Si la corriente es demasiado fuerte, el embrión no sobrevivió a la inyección. </li><li> Mientras observa a través del microscopio de disección, mover el plato de inyección de manera que el primer embrión está en el centro del campo. Mover la aguja de modo que está en contacto con ese embrión. Utilice el micromanipulador para perforar el embrión con la aguja. Nota: La pared vertical de la cubeta de agarosa mantendrá el embrión sea empujado a un lado por la aguja. </li><li> Deje que la solución inyectable fluya hacia el embrión 1 o 2 segundos y luego retire la aguja rápidamente. Si el embrión tiene más de una celda, inyectar cada célula individual. El uso de fórceps para reorientar el embrión para alinear la siguiente celda con la punta de la aguja. </li><li> Después de la primera embryse inyecta o, mover el plato para que la próxima embrión se encuentra en la posición de inyección y repita el procedimiento; continuará hasta que se hayan inyectado todos los embriones. </li></ol> 4. El cultivo y la eclosión de embriones <ol><li> Mover todos los embriones inyectados en un plato con algunos Hydra que tienen testículos (esto es para asegurar que todos los embriones son fertilizados). Incubar los embriones en una incubadora a 18 °, mientras continúan la embriogénesis. </li><li> Una vez que se alcanza la etapa de cutícula, mover cada embrión inyectado a un pozo individual de una placa de 24 pocillos con medio lleno Hydra. </li><li> Incubar los embriones inyectados durante 2 semanas en la oscuridad a 18 ° C. </li><li> Después del periodo de incubación de 2 semana, comprobar cada embrión inyectado bajo la lupa. Tenga en cuenta los casos en los que el embrión cutícula etapa ha desprendido de la pequeña muestra de tejido de los padres y el tejido de los padres ha regeneradas. Eliminar este pólipo regenerado inmediatamente de modo que no es mistaken de una nueva cría. </li><li> Mueva el plato de embriones inyectados bajo una luz del acuario a RT. Compruebe los platos cada día y recoger las crías. Nuevas crías serán blancas porque el típico color rosa de pólipos Hydra viene de la Artemia que comen. </li><li> Observar las crías bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la expresión del transgén. </li></ol>

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	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. 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N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydra reproduce asexualmente rutinariamente, pero requiere de estímulos ambientales para comenzar gametos productores. Estos estímulos no están bien definidas-para la mayoría de las especies Hydra y pueden diferir de cepa a cepa. Un obstáculo significativo a la producción de transgénicos Hydra es la obtención de embriones sobre una base regular, ya que puede resultar difícil en un entorno de laboratorio para inducir Hydra para convertirse sexual. La cepa AEP 25, si...

Hydra se ha utilizado para estudiar la regeneración, la formación de patrones, y las células madre para unos 250 años 2 Hydra tiene un plan de cuerpo simple que consiste en tres linajes celulares:. Epitelio ectodérmico, endodérmico epitelial y intersticial. El cuerpo tubular está formado por la ectodérmico y endodérmico linajes epiteliales, cada uno de los cuales es una sola capa de células. Todas las células epiteliales en la columna de la carrocería son mitótico. Cuando las células epiteliales se desplazan en las extremidades 3, la cabeza (boca y tentáculos) en el extremo oral o el pie (disco basal) en el extremo aboral, que detención en la fase G2 del ciclo celular y cambiar el destino celular 4. Las células del linaje intersticial residen dentro de los intersticios entre las células epiteliales. Este linaje es apoyado por las células madre multipotentes que se encuentran en la capa epitelial ectodérmica de la columna de cuerpo 5. Las células madre intersticiales dan lugar a tres cel somáticatipos l (nervios, células de la glándula, y nematocytes) y las células germinales 6,7. Como miembro del filo Cnidaria, el grupo hermano de todos los bilaterales, Hydra puede arrojar luz sobre los procesos biológicos fundamentales compartidos entre los animales multicelulares. Hasta hace poco, estos esfuerzos fueron obstaculizados por la falta de métodos fiables para la perturbación de la función génica. Sin embargo, con el desarrollo de la metodología transgénico 1, ahora somos capaces de sacar el máximo provecho de Hydra para obtener una mejor comprensión de los mecanismos básicos comunes a los animales multicelulares, como la función de células madre, la regeneración y el patrón. Líneas transgénicas Hydra son establecidos por inyección de plásmido de ADN en embriones, lo que resulta en la integración aleatoria y de expresión quimérico en una frecuencia sustancial de las crías. Una línea con expresión uniforme en un linaje particular puede ser establecida por la propagación asexual. La capacidad de propagar clonalmente transgENIC Hydra líneas es una ventaja sobre la mayoría de los modelos animales, que puede ser propagada sólo por reproducción sexual. Además, las células transgénicas se pueden rastrear fácilmente in vivo debido a la transparencia del animal y la ausencia de proteínas fluorescentes endógenos 8. En los siete años transcurridos desde las primeras líneas transgénicas Hydra fueron hechas 1, dichas líneas se han utilizado para una variedad de aplicaciones. La expresión de proteínas fluorescentes en diferentes tipos de células ha permitido rastrear el movimiento celular, observar los cambios en la forma de la célula, y la pista destino celular, tanto en condiciones de tipo salvaje y después de la perturbación química 1,5,9-12. Además, la expresión de diferentes proteínas fluorescentes en los diversos linajes permite el aislamiento de FACS de poblaciones celulares específicas. Esta técnica ha sido utilizada para la secuenciación de ARNm específicos de células madre y linaje específico de pequeños RNAs 13,14. Mientras que el promotor deuno de los dos genes de actina Hydra se ha utilizado más ampliamente, unos pocos de tipo celular promotores específicos han sido identificados y se utiliza para controlar la expresión de GFP en transgénicos Hydra 9,11,15,16. En el futuro, promotores específicos de tipo celular permitirá para la observación y la recogida de cualquier tipo de célula específico. Además, un enfoque transgénico se utilizó con éxito para definir los elementos reguladores que actúan en cis del promotor Wnt3 17. El desarrollo de métodos transgénicos en Hydra proporciona un enfoque robusto para probar la función de los genes por la expresión ectópica, la sobreexpresión, y caída. Los animales transgénicos se han hecho que expresan proteínas fluorescentemente marcadas con el fin de examinar la función y localización celular 18-20. Además, la expresión de ARN horquillas en el 3&#39;UTR de un transgén GFP lleva a desmontables de genes diana 21,22. En estos enfoques se requiere para identificar las buenas prácticas agrariasy rastrear el tejido transgénico durante la creación de la línea transgénica. Sin embargo, es probable que en algunos casos la molécula de GFP podría interferir con la función de la proteína etiquetada. Un estudio reciente demuestra que los genes Hydra pueden ser dispuestos en una configuración operón, es decir, se hacen polycistronic transcripciones, que luego son separados por trans-empalmados Además líder y traducido por separado 23. Mediante la colocación de un gen que codifica una proteína o un ARN de horquilla en la posición aguas arriba de un operón y un gen de proteína fluorescente en la posición aguas abajo, se puede realizar un seguimiento de tejido transgénico sin tener que etiquetar el gen que codifica la proteína o ARN de horquilla. Este método se ha utilizado para expresar una horquilla de ARN en una configuración operón con DsRed2 a fin de lograr gen desmontables 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

El establecimiento de líneas transgénicas de Hydra Alimente las crías transgénicas cada 2-3 días con nauplios de Artemia. Las crías a veces no comen por un día o dos después de la eclosión. Algunas de las nuevas crías nunca van a comer, y por lo tanto no va a sobrevivir. Si la cría es transgénica ya sea en el ectodérmica (Figura 1A) o tejido epitelial endodérmico, permitir que el animal brote y recoger los brotes que tienen el tejido más transg?...

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Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generación de transgénicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinyección de embriones

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

14.0K vistas.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biología

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Genética

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 Transgénesis embrionaria mediada por integrasa en Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor destacado: Optimización de la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Generación de transgénicos

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Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

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En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

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