Este protocolo nos permite generar hormigas modificadas genéticamente para comprender la función de los genes en la comunicación y el comportamiento en un entorno social. La manipulación del sistema genético de los insectos eusociales es un desafío, ya que muchas especies no se aparean y se reproducen en entornos de laboratorio. La sorprendente plasticidad fenotípica en el suelo celular hipernasal de la hormiga nos permite establecer líneas mutantes mediadas por CRISPR.
Demostrando el procedimiento estará Kayli Sieber, una estudiante graduada de un laboratorio. Mantenga colonias de H.saltator de tipo salvaje en cajas de plástico transparente en una sala de cría de hormigas a 22 a 25 grados centígrados y un horario de iluminación oscura de 12 horas de luz y 12 horas. Use cajas pequeñas para criar obreras individuales o colonias pequeñas y cajas medianas o grandes para criar colonias más grandes.
Para crear cajas nido, use yeso para hacer los pisos. A medida que el yeso húmedo se seca en las cajas medianas y grandes, presione un bloque de espuma en el yeso a unos pocos centímetros de profundidad y unos centímetros de la parte posterior de la caja para designar una región de nido inferior. Una vez que el yeso se haya secado, cubra la región designada del nido con una pieza cuadrada de vidrio.
Alimente a las colonias con grillos vivos dos veces por semana y aplique agua regularmente al piso de la caja nido de plástico con una botella de lavado. Siempre que se alimente, retire la basura y las personas muertas. Congele todos los desechos y hormigas muertas durante la noche a menos 30 grados centígrados antes de desechar estos materiales como basura regular.
Agregue periódicamente una pizca de aserrín seco a las colonias para ayudar a las larvas a medida que se someten a la pupación y para ayudar a las obreras a mantener limpia la caja nido. Utilice un extractor de micropipetas para tirar de las agujas de microinyección de vidrio. Asegúrese de que el vidrio que se utiliza se ha almacenado en un ambiente limpio y libre de polvo.
Utilice un proceso de dos pasos para extraer las agujas de microinyección. Para el primer paso, ajuste el calor a 575, el filamento a 3, la velocidad a 35, el retardo a 145 y la tracción a 75. Para el segundo paso, ajuste el calor a 425, el filamento a 0, la velocidad a 15, el retardo a 128 y la tracción a 200.
Asegúrese de que la aguja resultante tenga una conicidad de 2 milímetros y una punta de 0,5 micrómetros. Después de tirar de las agujas, manténgalas en un ambiente libre de polvo y limpio hasta que las use. Preparar la mezcla de microinyección de proteínas de caseína y ARN guía pequeños sintetizados in vitro.
Mantenga la mezcla en hielo hasta que sea el momento de cargar una aguja de microinyección. Cuando no esté en uso, guarde la mezcla de microinyección a menos 80 grados centígrados. Ajuste los parámetros de inyección a una presión de inyección de 140 hectopascal, una presión constante de 70 hectopascal y un tiempo de 0,4 segundos.
Ajuste la presión constante de modo que el material solo fluya en una dirección, y ajuste la presión y el tiempo de inyección solo si no fluye material desde la aguja hacia el embrión. Cargue una aguja de microinyección con dos microlitros de la mezcla utilizando puntas de pipeta de microcargador. Haga esto lentamente para asegurarse de que no se formen burbujas en la mezcla.
Rompa solo la punta de la aguja a lo largo del borde de la cinta, de modo que aún se mantenga un cono estrecho. Asegúrese de que la aguja esté rota lo suficiente como para que se abra la punta, pero no tanto como para que la conicidad se rompa. Luego monte la aguja en el micromanipulador.
Seleccione embriones para microinyección de la etapa sincitial, que es cuando los núcleos se dividen sin citocinesis. Forre los embriones en una placa de cinta adhesiva de doble cara pegada a un portaobjetos de microscopio de vidrio, asegurándose de que estén bien asegurados a la cinta para evitar el movimiento durante la inyección. Coloque los embriones en una orientación vertical tal que el lado lateral de cada embrión esté en el borde de la cinta.
Coloque el portaobjetos y los embriones revestidos en el escenario del microscopio en una estación de trabajo de microinyección designada. Alinee la aguja con el primer embrión que se inyectará con el micromanipulador y perfore lateralmente el primer embrión a lo largo de su eje dorsal o ventral bajo un microscopio. Inyecte la mezcla de microinyección y busque un ligero movimiento del embrión, lo que indica un aumento en la presión interna debido al líquido inyectado.
Además, observe la formación de una pequeña gota que contiene rastros visibles de tejido o lípidos en la membrana externa del embrión. Retire suavemente la aguja del embrión y proceda al siguiente embrión ajustando la posición del portaobjetos del microscopio. Repita hasta que todos los embriones hayan sido inyectados.
Una vez que todos los embriones en el portaobjetos hayan sido inyectados con éxito, transfiera el portaobjetos a una caja húmeda durante una hora para que los embriones tengan tiempo de recuperarse antes de ser retirados del portaobjetos. Después de la incubación, lave el portaobjetos con etanol, retire suavemente los embriones inyectados de la cinta con pinzas de peso pluma y transfiéralos a un tubo lleno de una pequeña cantidad de etanol al 70%. Invierta el tubo varias veces.
Usando un pincel pequeño y suave, transfiera todos los embriones inyectados a placas de agar al 1% con un antimicótico antibiótico al 2%. Incubar las placas a 25 grados centígrados durante aproximadamente cuatro semanas, verificando regularmente la eclosión. Una vez que el primer embrión haya eclosionado en una larva, devuelva todos los embriones y larvas a una caja nido con algunas enfermeras jóvenes para cuidar a las crías.
Mantener la colonia siguiendo los métodos previamente demostrados. Este protocolo se utilizó para realizar con éxito la edición del genoma en embriones saltadores de Harpegnathos. Los resultados se validaron mediante PCR y clonación pGEM de ADN extraído de embriones inyectados, seguido de secuenciación de ADN.
La eficiencia de la mutagénesis somática utilizando este protocolo alcanzó aproximadamente el 40% F1 de los machos mutantes que se aparearon con hembras de tipo salvaje para producir hembras F2 heterocigotas que, si no se apareaban, producían machos F3. Los machos mutantes F3 se aparearon con hembras heterocigotas para producir hembras mutantes homocigotas F4. Como resultado de la mutagénesis exitosa, se observaron comportamientos inusuales que se correlacionaron con la pérdida del gen diana.
La pérdida de Orco se asocia con una pérdida de detección de feromonas, incapacidad para detectar presas, alteración de la fecundidad y vagar fuera de la colonia. Al realizar este protocolo, el daño embrionario durante la inyección debe minimizarse. Esto se puede hacer asegurándose de que la punta de la aguja no se abra demasiado y moviendo la aguja lentamente al inyectarla.
Se pueden utilizar técnicas similares para generar y mantener hormigas transgénicas, lo que proporcionará herramientas más sofisticadas para sondear la actividad neuronal y el comportamiento. La neurogénesis mediada por CRISPR se ha utilizado en otras especies de insectos eusociales, como las abejas, las hormigas saqueadoras clonales y las hormigas de fuego. Las modificaciones genéticas facilitarán los estudios funcionales sobre el desarrollo, la fisiología y el comportamiento social en insectos eusociales.
