この作品は、HLにG.ハロルド＆レイラY.マザーズ賞でサポートされているとRESCEJにNIHの助成金（R24 GM080527）はNRSA博士研究員（NIH F32GM9037222）され、現在国立からの指導研究員開発賞でサポートされていた老化に関する研究所（K01AG04435）。私たちは、有益なコメントを頂いた査読に感謝したいと思います。

プラスミドDNA、針及び注射料理の調製<ol><li>高速マキシやミディキットを用いてプラスミドDNAを調製し、エタノール沈殿を用いて溶液を2.5mg / DNAに集中する。 DNAペレットをヌクレアーゼフリーの脱イオン水に溶解されるべきである。 -20℃で10〜20μlのアリコート中のDN​​Aを保管してください。 （入手可能なベクターのリストについては、 補足表1を参照してください） </li><li> 100×15ミリメートルペトリ皿に胚を保持するためのトラフを構築するためにアガロース用いて射出料理を作る。 <ol><li>角度で100×15ミリメートルペトリ皿に75×50ガラス顕微鏡スライドを配置します。ペトリ皿にヒドラ媒体 24内で溶融、2％アガロースの約50ミリリットル注ぐ。あるいは、第皿にアガロースを注ぎ、トップの「マイクロインジェクション魚モールド」をフロート。 </li><li>アガロースが固化した後、ガラススライドや金型を削除します。ガラススライドを使用した場合、剃刀のbla過剰アガロースを切り取るドは、壁を形成する。皿にハイドラ培地を注ぎ、すぐにそれを使用したり、必要になるまで4℃で保管してください。注：使用の間、4℃で保存した場合、注入皿を再利用することができる。 </li></ol></li><li>彼らがあるように、ペトリ皿中の粘土の狭いストリップにそれらを押すことで、熱525、75を引いて、速度100、時間50店舗針：以下の条件を用いてプラーマイクロピペット上のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーから針を引き出します皿の底に平行に保持。 </li><li>注射液を調製し、10％のフェノールレッドの2μlの2.5 mg / mlのプラスミドDNA溶液を3μlを組み合わせること。溶液を短時間ボルテックスし、次いで針を詰まらせる可能性のある粒子を除去するために微量に最大速度で10分間、それを回す。 </li><li>解剖顕微鏡下で、小さな開口部を作成するためにピンセットで先端から針数ミリメートルのクリップ。注：オープンの適切なサイズに多少の柔軟性があります圧力がこの変化に対応するために、ステップ3.3に調整することができるのでる。 </li><li>それは、先端を下にして垂直に針を保持しているように、ペトリ皿を置きます。針の後端に液体をピペッティングすることにより注射液の約0.5μlの針をロードします。毛細管現象を針の先端に解決策を引っ張るようにします。 </li></ol>注射用胚の作製<ol><li>毎日のように卵を生産するためのポリープハイドラ AEP株文化をスキャンします。これらのポリープを収集し、別の培養皿に保管します。卵形成の進行状況を監視するために、日中、これらのポリープを数時間ごとに観察します。卵は外胚葉を突破と後退外胚葉細胞のリングの上に座るとき、彼らは注射の25の準備ができている。受精を可能にするために、注入前に少なくとも1時間精巣を持つ複数のハイドラと皿にこれらのポリープを置きます。 ハイドラ&lt;/ em&gt;の男性は、特別な操作を行わずに精子を放出する。 </li><li>メスが完全に形成された約400μmの直径が25である、卵、または1〜8細胞期胚とAEPコロニーで発見された場合、また、注射のために、これらを収集します。すぐに切断し始めている胚を注入する。注：これは、完全に形成された卵や単細​​胞接合体の違いを見分けることができず、従って、これらは、注射前に男性と一緒にインキュベートされるべきである。 </li><li>注射の前に、＃15刃でメスを用いて胚の上下に親の組織の大部分を除去。取付体列の小片でのみ胚を残すが、必要に応じて鉗子で胚を操作するために使用される。注：胚から離れて解剖されている組織が ​​再生成され、女性はハイドラコロニーに残ることを保証するために保存する必要があります。 </li><li>パスツールピペットを用いて、それらの壁に平行に配置し、注入皿に胚を移動アガローストラフ。 </li></ol>プラスミドDNAの3マイクロインジェクション<ol><li>鉄板に座っ磁気スタンドにインジェクターをマウントします。ジョイスティックマイクロマニピュレーターで、針を保持しているマイクロインジェクターの一部であるインジェクションホルダーをマウントします。マグネチックスタンドで、鉄板にジョイスティックマニピュレータをマウントします。解剖顕微鏡の右側にあるこの全体のセットアップを置き、観察視野に表示されているように、注射ホルダーを配置します。 </li><li>アガローストラフの垂直壁が左にあるように配向解剖顕微鏡下で胚を注射料理を置きます。インジェクションホルダーに針を挿入し、皿にハイドラ媒体への針の先端を下げる。 </li><li>鉱物油は、針の上部を満たし、注射液の安定した流れがHydrに針を出観察されるまでゆっくりと時計回りの方向に注射器のノブを回すミディアム。ストリームが強すぎると、反時計回りにノブを回して圧力を下げる。日常（針がステップ1.5にクリップされたか、すなわち ）針開口部の大きさに依存する適切な圧力を得るために、このステップを練習。注：ストリームが強すぎると、胚は注入を生き残ることはありません。 </li><li>解剖顕微鏡を通して見ながら最初の胚は、フィールドの中心にあるように、注射用の皿を移動します。それがその胚に触れているように、針を移動します。針で胚を貫通するマイクロマニピュレーターを使用してください。注：アガローストラフの垂直壁は、針でわき押されてから胚を維持します。 </li><li>注射液は、胚1または2秒に流入し、その後すぐに針を除去することを許可します。胚は複数のセルを有する場合、個別のセルを注入する。針の先端で次のセルを整列させるために胚を再配向するために鉗子を使用してください。 </li><li>最初エンブリーの後oは次胚が注入位置となるように皿を移動し、手順を繰り返し、注入される;すべての胚が注入されるまで継続する。 </li></ol> 4。胚の培養および孵化<ol><li>精巣を持つ少数のハイドラと皿に注入した胚のすべてを移動します（これはすべての胚が受精していることを確認することです）。彼らは胚形成を継続しながら、18℃のインキュベーター内で胚をインキュベートする。 </li><li>キューティクル段階に達すると、 ハイドラ媒体が充填された24ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ注入された胚を移動させる。 </li><li> 18℃の暗所で2週間注入した胚をインキュベートする。 </li><li> 2週間の潜伏期間の後、解剖顕微鏡下でそれぞれ注入された胚をご確認ください。キューティクル段階の胚は、親組織の小片から切り離されており、親の組織が再生していたいずれの場合に注意してください。それはマイルにならないように、すぐにこの再生されたポリープを削除する新しい雛のためにstaken。 </li><li> RTで水槽の光の下で注入した胚の皿を移動します。毎日のプレートを確認し、孵化を収集します。 ハイドラポリープの典型的なピンク色は、彼らが食べるアルテミアから来ているので、新孵化は白になります。 </li><li>導入遺伝子の発現を検出するために、蛍光顕微鏡下で孵化を観察します。 </li></ol>

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	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydraは日常的に無性再現しますが、配偶子の生産を開始する環境刺激を必要とします。これらの刺激はほとんどハイドラ種について、明確に定義されておらず、歪み歪みと異なる場合があります。それは性的になるためにハイドラを誘導するために実験室の設定で困難な場合がありますので、トランスジェニックハイドラの生産に重要なハードルは定期的に胚を得?...

Hydraは再生、パターン形成を研究し、約250年2のための幹細胞に使用されているHydraは 3つの細胞系統からなるシンプルなボディープランがあります。外胚葉上皮、内胚葉上皮と間質を。管状体は、単一の細胞層でそれぞれが外胚葉と内胚葉上皮系統によって形成される。体内の欄の上皮細胞のすべてが有糸分裂である。上皮細胞は、尾方端に経口端部または足に四肢3、ヘッド（口および触手）（基礎円板）に変位するとき、それらは、細胞周期のG2期で停止させると、細胞の運命4を変更する。間質細胞系統の細胞は、上皮細胞間の隙間内に存在する。この系統は、本体コラム5の外胚葉上皮層に位置している多能性幹細胞でサポートされています。間質幹細胞を3セルの体細胞を生じさせるLタイプ（神経、腺細胞、およびnematocytes）と生殖細胞6,7。 門刺胞動物、すべてbilateriansの姉妹グループの一員として、Hydraは多細胞動物の間で共有の基本的な生物学的プロセスに光を当てることができます。最近まで、これらの努力は、遺伝子機能の摂動のための信頼できる方法の欠如により妨げられた。しかし、トランスジェニック手法1の開発を、私たちは今、幹細胞機能、再生、およびパターニングなどの多細胞動物に共通する基本的なメカニズムのよりよい理解を得るためにハイドラを最大限に活用することができます。トランスジェニックヒドララインは、孵化のかなりの頻度でランダムな組み込みおよびキメラ発現をもたらす胚へのプラスミドDNAの注射によって確立される。特定の系列に均一発現とラインが無性繁殖によって確立することができる。クローン的transgを増殖させる能力ENIC ヒドララインは、有性生殖により増殖することができる動物モデルの大部分よりも有利で ​​ある。また、トランスジェニック細胞は、動物の透明性および内因性蛍光タンパク質8が存在しない場合にインビボで容易に追跡することができる。 第一のトランスジェニックヒドラ線が1行われたので、7年間、そのような線は、さまざまな用途に使用されてきた。異なる細胞型における蛍光タンパク質の発現は、細胞の動きを追跡する細胞形状の変化を観察し、野生型条件および化学的摂動1,5,9-12後の両方において細胞の運命を追跡することが可能となった。また、さまざまな系統の異なる蛍光タンパク質の発現は、特定の細胞集団のFACS単離を可能にする。この技術は、幹細胞特異的mRNAおよび系統特異的低分子RNA 13,14の配列決定のために使用されてきた。プロモーターの一方2 ヒドラアクチン遺伝子の一つは、最も広く使用されているいくつかの細胞型特異的プロモーターを同定し、トランスジェニックヒドラ 9,11,15,16でGFPの発現を駆動するために使用されている。将来的には、細胞型特異的プロモーターは、任意の特定の細胞型の観察および回収を可能にする。また、トランスジェニックアプローチは、成功しWnt3をプロモーター17のシス作用調節エレメントを定義するために使用された。 ハイドラにおけるトランスジェニック方法の開発が異所性発現、過剰発現、およびノックダウンにより遺伝子の機能をテストするための堅牢なアプローチを提供します。トランスジェニック動物は、機能および細胞局在18-20の両方を検討するために、蛍光標識タンパク質を発現することが行われている。また、GFP導入遺伝子の3&#39;UTR中のRNAヘアピンの発現は、標的遺伝子21,22のノックダウンにつながる。これらのアプローチでは、GFPを識別するために必要とされているトランスジェニックラインの作成中にトランスジェニック組織を追跡します。しかしながら、いくつかのケースではGFP分子は、タグ付きタンパク質の機能を妨害する可能性がある。最近の研究では、 イドラ遺伝子がオペロン構成に配置することができることを実証する、 すなわち、多シストロン性転写物はその後、トランス-スプライスリーダーを添加することにより分離し、個別に23翻訳される、作製される。タンパク質またはオペロンと下流位置における蛍光タンパク質遺伝子の上流位置でヘアピンRNAをコードする遺伝子を配置することによって、人は、タンパク質またはRNAヘアピンをコードする遺伝子をタグ付けすることなく、トランスジェニック組織を追跡することができる。この方法は、14遺伝子ノックダウンを達成するためにDsRed2のとオペロン構成のRNAヘアピンを発現するために使用されてきた。

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

トランスジェニックハイドララインの確立 アルテミアノープリウスを2〜3日ごとジェニック孵化フィード。孵化は時に孵化後一日か二日のために食べてはいけない。いくつかの新しい孵化は食べることはありませんので、生き残ることはありません。雛は、外胚葉（ 図1A）または内胚葉上皮組織のいずれかでトランスジェニックであれば、動物は?...

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Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

トランスジェニックの世代<em&gt;ハイドラ</em&gt;胚マイクロインジェクションによる

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

14.0K ビュー.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

発生生物学

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

生物学

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

遺伝学

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

ショウジョウバエにおけるphiC31インテグラーゼ媒介胚導入

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

著者スポットライト:ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションの最適化

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

神経フリーの生成と長期維持<em&gt;ヒドラ</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

トランスジェニックの世代

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幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

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細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

神経フリーの生成と長期維持