Name: generation of transgenic hydra by embryo microinjection
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
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Este trabalho foi apoiado por uma G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Award para HL e uma subvenção NIH (R24 GM080527) para RESCEJ foi um NRSA Pós-Doutorado (NIH F32GM9037222) e está apoiada por uma Scientist Award Desenvolvimento Mentored Pesquisa da National Instituto do Envelhecimento (K01AG04435). Gostaríamos de agradecer aos revisores pelos comentários úteis.

1 Preparação de plasmídeo de DNA, agulhas e injeção Pratos <ol><li> Prepare o DNA de plasmídeo utilizando um kit de alta velocidade ou Maxi Midi e concentra-se o ADN para 2,5 mg / ml usando a precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser dissolvido em água livre de nuclease desionizada. Armazenar o ADN em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. (Ver Quadro Suplementar 1 para uma lista de vetores disponíveis) </li><li> Faça um prato de injeção utilizando agarose para construir uma calha para a realização de embriões em uma placa de Petri de 100 x 15 mm. <ol><li> Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 x 50 em um 100 x 15 mm numa caixa de Petri com um ângulo. Despeje a cerca de 50 ml de 2% de agarose em forma derretida Hidra 24 para a placa de Petri. Alternativamente, despeje a agarose para o prato primeiro e flutuar um &quot;molde microinjeção Fish&quot; no topo. </li><li> Após o ágar ter solidificado, remover a lâmina de vidro, ou o molde. Se foi usada uma lâmina de vidro, corte o excesso de agarose com um bla navalhade formar uma parede. Despeje meio Hydra no prato e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 4 ° C até ser necessário. Nota: pratos de injecção pode ser reutilizado se for armazenado a 4 ° C entre as utilizações. </li></ol></li><li> Puxar agulhas capilares de vidro de borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta usando as seguintes condições: 525 aquecer, puxar 75, a velocidade de 100, o tempo da loja 50. as agulhas, pressionando-os para uma estreita faixa de argila, em uma placa de Petri de tal modo que eles são mantida paralelamente ao fundo do prato. </li><li> Para preparar a solução para injecção, combinar 3 uL de solução de ADN de plasmídeo de 2,5 mg / mL com 2 mL de 10% de vermelho de fenol. Vortex a solução brevemente e em seguida girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga para remover quaisquer partículas que podem entupir a agulha. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, o clipe de agulha alguns milímetros da ponta com uma pinça para criar uma pequena abertura. Nota: Existe uma certa flexibilidade no tamanho adequado do abertoing porque a pressão pode ser ajustada na etapa 3.3 para acomodar esta variação. </li><li> Colocar a placa de Petri de modo a que é segura a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Coloque a agulha com cerca de 0,5 ml de solução de injecção por pipetagem do líquido para dentro da extremidade posterior da agulha. Permitir uma acção capilar para puxar a solução para dentro da ponta da agulha. </li></ol> 2 Preparação de embriões para Injeção <ol><li> Em uma base diária digitalizar a cultura tensão Hydra AEP para pólipos produtoras de ovos. Colete estes pólipos e retirá-las em um prato de cultura independente. Observe estes pólipos cada poucas horas durante o dia para monitorar o progresso de formação do ovo. Quando os ovos quebram através do ectoderma e sentar-se em um anel de células ectodérmicas retraídos eles estão prontos para a injeção 25. Colocar estes pólipos em um prato com vários hidra que têm testículos durante pelo menos 1 hora antes da injecção para permitir a fertilização. Hidra &lt;/ Em&gt; machos vai liberar esperma sem qualquer manipulação especial. </li><li> Se as fêmeas são encontrados na colónia AEP com ovos completamente formados, que são aproximadamente de 400 um de diâmetro de 25, ou de 1 a 8, embriões nos estágios de células, também recolher estes injectável. Injetar imediatamente embriões que começaram clivagem. Nota: Não é possível dizer a diferença entre os ovos totalmente formadas e zigotos unicelulares, portanto, estes devem ser incubadas com os homens antes da injeção. </li><li> Antes da injecção, remover a maior parte do tecido parental acima e abaixo do embrião utilizando um bisturi, com uma lâmina de # 15. Deixar apenas o embrião com um pequeno pedaço de coluna corpo ligado, para ser utilizada para manipular o embrião com uma pinça, se necessário. Nota: O tecido que é dissecado a partir do embrião irá regenerar e deve ser guardada para assegurar que permanecem fêmeas na colónia Hidra. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur, mover os embriões para o prato de injecção, dispondo-os em paralelo à parede docalha de agarose. </li></ol> 3. microinjecção de ADN do plasmídeo <ol><li> Monte o microinjetor em um suporte magnético que fica em uma chapa de ferro. Montar o suporte da injecção, que é a parte da microinjector que prende a agulha, em um micromanipulador joystick. Monte o manipulador joystick para a chapa de ferro, com um suporte magnético. Coloque esta todo o conjunto para cima no lado direito de um microscópio de dissecção e posiciona o porta-injecção de modo que seja visível no campo de observação. </li><li> Coloque o prato de injecção com embriões sob o microscópio de dissecação, orientada de tal modo que a parede vertical da calha de agarose é para a esquerda. Inserir a agulha no suporte de injecção e diminuir a ponta da agulha para o meio de Hidra no prato. </li><li> Lentamente, rodar o botão da seringa na direcção dos ponteiros do relógio até que o óleo mineral preenche a parte superior da agulha e um fluxo constante de solução de injecção é observado sai da agulha no hidrum meio. Se o fluxo é muito forte, diminuir a pressão, girando o botão para a esquerda. Praticar este passo para obter rotineiramente uma pressão adequada, o que depende do tamanho da abertura da agulha (ou seja, a forma como a agulha foi cortado no passo 1.5). Nota: Se a corrente é muito forte, o embrião não irá sobreviver a injeção. </li><li> Durante a visualização através de um microscópio de dissecação, movimentar o prato de injecção de modo a que o primeiro embrião está no centro do campo. Mover a agulha de modo que ela está a tocar que embrião. Usar o micromanipulador para perfurar o embrião com a agulha. Nota: A parede vertical da calha agarose vai manter o embrião do que está sendo deixado de lado pela agulha. </li><li> Permitir que a solução de injeção a fluir para o embrião 1 ou 2 segundos e, em seguida, remover a agulha rapidamente. Se o embrião tem mais de uma célula, injectar cada célula individual. Use uma pinça para reorientar o embrião para alinhar a célula seguinte, com a ponta da agulha. </li><li> Após o primeiro embryo é injectado, movimentar o prato de modo a que o lado do embrião está na posição de injecção e repetir o procedimento; continuar até que todos os embriões foram injectados. </li></ol> 4 A cultura ea eclosão dos embriões <ol><li> Mover todos os embriões injectados em um prato com algumas hidra que têm testículos (isto é para assegurar que todos os embriões são fertilizados). Incubar os embriões em um 18 ° C incubadora, enquanto eles continuam a embriogênese. </li><li> Uma vez que a fase de cutícula é atingido, mover cada embrião injectado para um poço individual de uma placa de 24 poços cheios com meio de hidra. </li><li> Incubar os embriões injectados durante 2 semanas no escuro a 18 ° C. </li><li> Após o período de incubação duas semanas, verifique cada embrião injetado sob o microscópio de dissecação. Observe quaisquer casos em que o embrião cutícula estágio se soltou do pequeno pedaço de tecido parental eo tecido dos pais tenha regenerado. Remover este pólipo regenerado imediatamente para que ele não é mistaken de um novo filhote. </li><li> Mova o prato de embriões injetados sob a luz do aquário à temperatura ambiente. Verifique as placas de cada dia e recolher filhotes. Novos filhotes será branco porque a cor-de-rosa típico de pólipos Hydra vem da Artemia eles comem. </li><li> Observe os filhotes debaixo de um microscópio de fluorescência para detectar a expressão do transgene. </li></ol>

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	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. 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N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydra rotineiramente reproduz de forma assexuada, mas requer estímulos ambientais para começar gametas produtores. Esses estímulos não são bem definidos para a maioria das espécies de Hydra e podem variar de estirpe para estirpe. Um obstáculo significativo para a produção de Hidra transgénico é a obtenção de embriões numa base regular porque pode ser difícil num ambiente laboratorial para induzir a tornar-se Hydra sexual. A estirpe AEP 25, no entanto, produz ...

Hydra foi usado para estudar a regeneração, formação de padrões, e as células-tronco para cerca de 250 anos 2 Hydra tem um plano corporal simples, que consiste de três linhagens de células:. Epitelial ectodérmica, endodérmica epitelial e intersticial. O corpo tubular é formado por o ectodérmico e linhagens epiteliais da endoderme, cada um dos quais é uma camada única de células. Todas as células epiteliais no corpo da coluna são mitótico. Quando as células epiteliais são deslocados para as extremidades 3, a cabeça (boca e tentáculos) na extremidade bucal ou do pé (disco basal) na extremidade aboral, eles prendem na fase G2 do ciclo celular e alterar o destino da célula 4. As células da linhagem intersticial residem dentro dos interstícios entre as células epiteliais. Esta linhagem é apoiada por células-tronco multipotentes que estão localizados na camada epitelial ectodérmica da coluna corpo 5. As células estaminais intersticiais dar origem a três cel somáticatipos l (nervos, células glandulares, e nematocytes) e as células germinativas 6,7. Como um membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterians, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre os animais multicelulares. Até recentemente, esses esforços foram impedidos pela falta de métodos confiáveis ​​para a perturbação da função dos genes. No entanto, com o desenvolvimento de metodologia transgênico 1, somos agora capazes de tirar o máximo proveito de Hydra para obter uma melhor compreensão dos mecanismos básicos comuns a animais multicelulares, como a função de células-tronco, regeneração e padronização. Linhas Transgénicas Hydra são estabelecidos por injecção de plasmídeo de ADN em embriões, o que resulta na integração aleatória e expressão quimérico com uma frequência significativa de filhotes. Uma linha com expressão uniforme numa linhagem particular pode ser estabelecida por propagação vegetativa. A capacidade de propagar clonalmente transgenic Hidra linhas é uma vantagem sobre a maioria dos modelos de animais, que pode ser propagado somente por reprodução sexuada. Além disso, as células transgénicas podem ser facilmente rastreados in vivo, devido à transparência do animal e a ausência de proteínas fluorescentes endógenos 8. Nos sete anos desde as primeiras linhas Hydra transgênicas foram feitas 1, essas linhas foram usados ​​para uma variedade de aplicações. Expressão de proteínas fluorescentes em diferentes tipos de células tornou possível controlar o movimento celular, observar as alterações na forma da célula, e rastrear destinos celulares, tanto em condições de tipo selvagem e depois perturbação química 1,5,9-12. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes diferentes nas diversas linhagens de FACS permite o isolamento de populações de células específicas. Esta técnica tem sido utilizada para o seqüenciamento de mRNAs específicos de células-tronco e de linhagem específica pequenos RNAs 13,14. Enquanto o promotor deum dos dois genes da actina Hidra tem sido mais amplamente utilizado, a poucos tipos de células-promotores específicos foram identificados e utilizados para dirigir a expressão da GFP em Hydra 9,11,15,16 transgénico. No futuro, os promotores específicos do tipo de célula irá permitir a observação e recolha de qualquer tipo de célula específico. Além disso, uma abordagem transgénica foi utilizado com sucesso para definir os elementos reguladores que actuam em cis do promotor Wnt3 17. O desenvolvimento de métodos transgênicos em Hydra oferece uma abordagem robusta para testar a função dos genes pela expressão ectópica, superexpressão e knockdown. Os animais transgénicos que foram feitos expressar as proteínas marcadas com fluorescência, de modo a examinar tanto a função e localização celular de 18-20. Além disso, a expressão de ARN de gancho de cabelo na 3&#39;UTR de um transgene GFP leva a knockdown de genes alvo 21,22. Nessas abordagens GFP é necessário para identificare rastrear o tecido transgénico durante a criação da linha transgénica. No entanto, é provável que, em alguns casos, a molécula GFP iria interferir com a função da proteína etiquetada. Um estudo recente demonstra que os genes Hydra podem ser dispostas numa configuração operão, por exemplo, transcrições policistrónico são feitos, os quais são então separados por adição líder trans-splicing e traduzidos em separado 23. Ao colocar um gene que codifica uma proteína ou um gancho de cabelo de ARN na posição a montante de um operão e um gene de proteína fluorescente na posição de jusante, pode-se controlar o tecido transgénico sem ter que marcar o gene que codifica a proteína ou RNA hairpin. Este método tem sido utilizado para expressar um gancho de cabelo de ARN de um operão com DsRed2 configuração, a fim de alcançar gene knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Estabelecer linhas de Hydra transgênicos Alimentar filhotes transgênicas a cada 2-3 dias com náuplios de Artemia. Os filhotes, por vezes, não comer por um ou dois dias após a eclosão. Alguns novos filhotes nunca vai comer, e, portanto, não vai sobreviver. Se o filhote é transgénicos quer na ectodérmica (Figura 1A) ou o tecido epitelial endodérmica, permitir que o animal a germinar e recolher as gemas que têm a maioria dos tecidos transgénicos <str...

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Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

14.0K visualizações.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Vídeo: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Genética

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

FiC31 Transgênese embrionária mediada por integrase em Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor em destaque: Otimizando a microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Geração de Transgênicos

Resumo

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Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

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Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free