Questo lavoro è stato sostenuto da un G. Harold e Leila Y. Mathers Premio per HL e una sovvenzione NIH (R24 GM080527) per RESCEJ stato un NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) ed è attualmente supportato da un Mentored Research Scientist Development Award dal National Institute on Aging (K01AG04435). Vorremmo ringraziare i revisori per utili commenti.

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione <ol><li> Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili) </li><li> Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm. <ol><li> Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm Petri in un angolo. Versare circa 50 ml di 2% agarosio sciolto in Hydra medio 24 nella piastra di Petri. In alternativa, versare l&#39;agarosio nel piatto prima e galleggiare un &quot;Microiniezione pesce Mold&quot; in alto. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino o lo stampo. Se è stato utilizzato un vetrino, tagliare via l&#39;eccesso di agarosio con un bla rasoiode per formare un muro. Versare Hydra media nel piatto e utilizzare immediatamente o conservarlo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: i piatti iniezione possono essere riutilizzati se conservato a 4 ° C tra usi. </li></ol></li><li> Tirare aghi da capillari in vetro borosilicato con un filamento sul estrattore micropipetta con le seguenti condizioni: scaldare 525, tirare 75, velocità 100, tempo 50. Conservare gli aghi di loro premendo in una stretta striscia di argilla in una capsula di Petri tale che siano tenuto parallelo al fondo del piatto. </li><li> Per preparare la soluzione iniettabile, combinare 3 ml di / soluzione di DNA plasmidico ml 2,5 mg con 2 ml di 10% di rosso fenolo. Vortex la soluzione brevemente e poi girare per 10 min alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero intasare l&#39;ago. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, agganciare l&#39;ago a pochi millimetri dalla punta con una pinza per creare una piccola apertura. Nota: Vi è una certa flessibilità nella dimensione appropriata del apertozione perché la pressione può essere regolata nel passaggio 3.3 per accogliere questa variazione. </li><li> Porre la capsula di Petri in modo che sta tenendo l&#39;ago in posizione verticale con la punta verso il basso. Caricare l&#39;ago con circa 0,5 ml di soluzione iniettabile pipettando liquido nell&#39;estremità posteriore dell&#39;ago. Lasciare azione capillare per tirare la soluzione nella punta dell&#39;ago. </li></ol> 2 Preparazione di embrioni per iniezione <ol><li> Su base giornaliera eseguire la scansione della cultura ceppo Hydra AEP per polipi producono uova. Raccogliere questi polipi e metterli da parte in un piatto di cultura separata. Osservare questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l&#39;andamento della formazione dell&#39;uovo. Quando le uova si rompono attraverso l&#39;ectoderma e si siedono su un anello di cellule ectodermiche retratti sono pronti per l&#39;iniezione 25. Posizionare questi polipi in un piatto con diversi Hydra che hanno testicoli per almeno 1 ora prima dell&#39;iniezione per consentire la fecondazione. Hydra &lt;/ Em&gt; maschi rilascerà spermatozoi senza alcuna manipolazione speciale. </li><li> Se le femmine si trovano nella colonia AEP con uova completamente formate, che sono circa 400 micron di diametro 25, o da 1 a 8 celle embrioni stadio, raccogliere anche questi per l&#39;iniezione. Iniettare immediatamente gli embrioni che hanno iniziato scissione. Nota: Non è possibile capire la differenza tra le uova completamente formate e zigoti unicellulari, quindi questi devono essere incubate con i maschi prima dell&#39;iniezione. </li><li> Prima dell&#39;iniezione, rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto l&#39;embrione utilizzando un bisturi con lama # 15. Lasciare solo l&#39;embrione con un piccolo pezzo di colonna corpo attaccato, da utilizzare per manipolare l&#39;embrione con una pinza se necessario. Nota: Il tessuto che viene sezionato dalla embrione si rigenera e dovrebbe essere salvato per garantire che le femmine rimangono nella colonia di Hydra. </li><li> Usando una pipetta Pasteur, spostare embrioni al piatto di iniezione, disponendole parallele alla parete dellaattraverso agarosio. </li></ol> 3. Microiniezione di DNA plasmidi <ol><li> Montare il microinjector su un supporto magnetico che si siede su una lastra di ferro. Montare il supporto di iniezione, che è la parte del microinjector che contiene l&#39;ago, su un micromanipolatore joystick. Montare il manipolatore joystick per la piastra di ferro, con un supporto magnetico. Posizionare questo intero set-up sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto di iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione. </li><li> Porre la capsula iniezione con embrioni al microscopio da dissezione, orientato in modo tale che la parete verticale della vasca agarosio è a sinistra. Inserire l&#39;ago nel supporto di iniezione e abbassare la punta dell&#39;ago nel mezzo Hydra nel piatto. </li><li> Ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino olio minerale riempie la parte superiore dell&#39;ago e un flusso continuo di soluzione iniettabile si osserva uscire l&#39;ago nel Hydrun mezzo. Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Pratica questo passo per ottenere ordinariamente una pressione adeguata, che dipende dalle dimensioni dell&#39;apertura dell&#39;ago (cioè, come l&#39;ago è stato fermato nella fase 1.5). Nota: Se il flusso è troppo forte, l&#39;embrione non sopravviverà l&#39;iniezione. </li><li> Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, spostare il piatto iniezione, in modo che il primo embrione è al centro del campo. Spostare l&#39;ago in modo che sia a contatto con quella dell&#39;embrione. Utilizzare il micromanipolatore per perforare l&#39;embrione con l&#39;ago. Nota: La parete verticale della vasca agarosio manterrà l&#39;embrione di essere messo da parte dal ago. </li><li> Lasciare che la soluzione iniettabile di fluire in embrione 1 o 2 secondi e poi rimuovere l&#39;ago rapidamente. Se l&#39;embrione ha più di una cella, iniettare ogni cella singolarmente. Usare pinze per riorientare l&#39;embrione per allineare la cella successiva con la punta dell&#39;ago. </li><li> Dopo il primo Embryo viene iniettato, spostare il piatto in modo che la prossima embrione è nella posizione di iniezione e ripetere la procedura; continuare fino a quando sono state iniettate tutti gli embrioni. </li></ol> 4. coltura e cova di embrioni <ol><li> Spostare tutti gli embrioni iniettati in un piatto con un paio di Hydra che hanno testicoli (questo è quello di garantire che tutti gli embrioni sono fecondati). Incubare gli embrioni in un 18 ° C incubatore mentre continuano embriogenesi. </li><li> Una volta raggiunta la fase della cuticola, spostare ogni embrione iniettato ad un pozzo individuale di una piastra da 24 pozzetti riempiti con Hydra medie. </li><li> Incubare gli embrioni iniettati per 2 settimane al buio a 18 ° C. </li><li> Dopo il periodo di incubazione 2 settimane, controllare ogni embrione iniettato sotto il microscopio da dissezione. Nota casi in cui l&#39;embrione cuticola stadio ha staccati dal piccolo pezzo di tessuto parentale e il tessuto dei genitori ha rigenerati. Rimuovere questo polipo rigenerato immediatamente in modo che non è mistaken per un nuovo cucciolo. </li><li> Spostare il piatto di embrioni iniettati sotto una luce acquario a temperatura ambiente. Controllare le piastre ogni giorno e raccogliere larve. Le nuove larve saranno bianco perché il tipico colore rosa di polipi Hydra nasce dalla Artemia di cui si nutrono. </li><li> Osservare i piccoli sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l&#39;espressione del transgene. </li></ol>

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	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l&#39;ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP 25, tuttavia, produce ...

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni 2 Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell&#39;epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità 3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fase G2 del ciclo cellulare e cambiate destino cellulare 4. Le cellule della linea interstiziale risiedono negli interstizi tra le cellule epiteliali. Questa linea è sostenuta da cellule staminali multipotenti che si trovano nello strato epiteliale ectodermica della colonna corpo 5. Le cellule staminali interstiziali danno origine a tre cel somaticaTipi L (nervi, cellule della ghiandola, e nematocytes) e le cellule germinali 6,7. Come membro del phylum Cnidari, il gruppo sorella a tutti bilaterians, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali multicellulari. Fino a poco tempo, questi sforzi sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi affidabili per la perturbazione della funzione del gene. Tuttavia, con lo sviluppo della metodologia transgenica 1, siamo ora in grado di sfruttare appieno Hydra per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di base comuni ad animali pluricellulari, come ad esempio la funzione delle cellule staminali, la rigenerazione, e patterning. Linee transgeniche Hydra sono stabiliti mediante iniezione di DNA plasmidico in embrioni, che si traduce in integrazione casuale ed espressione chimerico in frequenza sostanziale di larve. Una linea con l&#39;espressione uniforme in un particolare lignaggio può essere stabilita per propagazione asessuata. La capacità di propagare clonale transgENIC Hydra righe è un vantaggio rispetto alla maggior parte dei modelli animali, che possono essere propagate solo da riproduzione sessuale. Inoltre, cellule transgeniche possono essere seguiti facilmente in vivo a causa della trasparenza dell&#39;animale e l&#39;assenza di proteine ​​fluorescenti endogene 8. Nei sette anni dalla prima linea Hydra transgeniche sono state effettuate 1, tali linee sono stati utilizzati per una varietà di applicazioni. Espressione di proteine ​​fluorescenti in diversi tipi di cellule ha permesso di monitorare il movimento delle cellule, osservare cambiamenti di forma delle cellule, e tenere traccia destini cellulari sia in condizioni di tipo selvatico e dopo perturbazione chimica 1,5,9-12. Inoltre, l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti differenti nelle diverse linee consente FACS isolamento di specifiche popolazioni cellulari. Questa tecnica è stata utilizzata per la sequenza di mRNA specifici di cellule staminali e le specifiche del lineage piccoli RNA 13,14. Mentre il promotore diuno dei due geni di actina Hydra è stato più utilizzato, a poche cellule di tipo promotori specifici sono stati identificati e utilizzati per guidare l&#39;espressione di GFP in transgenici Hydra 9,11,15,16. In futuro, i promotori specifici delle cellule di tipo permetteranno l&#39;osservazione e la raccolta di qualsiasi tipo di cellula specifico. Inoltre, un approccio transgenico è stato usato con successo per definire cis-agenti elementi regolatori del promotore Wnt3 17. Lo sviluppo di metodi transgenici in Hydra fornisce un valido approccio per testare la funzione dei geni dall&#39;espressione ectopica, sovraespressione, e atterramento. Gli animali transgenici sono stati fatti che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato, al fine di esaminare sia la funzione e la localizzazione cellulare 18-20. Inoltre, l&#39;espressione di forcine RNA nel 3&#39;UTR di un transgene GFP conduce atterramento di geni bersaglio 21,22. In questi approcci è necessaria GFP per identificaree monitorare il tessuto transgenico durante la creazione della linea transgenica. Tuttavia, è probabile che in alcuni casi la molecola GFP potrebbe interferire con la funzione della proteina tag. Uno studio recente dimostra che i geni Hydra possono essere organizzati in una configurazione operone, cioè, trascrizioni policistronici sono fatti, che vengono poi separati da trans-impiombato Inoltre leader e tradotto separatamente 23. Inserendo un gene codificante una proteina o una forcina RNA nella posizione a monte di un operone e un gene della proteina fluorescente nella posizione a valle, si può tracciare tessuto transgenico senza dover codificare il gene codificante la proteina o RNA hairpin. Questo metodo è stato utilizzato per esprimere un tornante RNA in una configurazione operone con DsRed2 al fine di raggiungere gene knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Stabilire linee transgeniche Hydra Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all&#39;animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C).<...

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Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

14.0K Views.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Genetica

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 Transgenesi embrionale mediata dall'integrasi in Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Generazione di transgenici

Riepilogo

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Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi