Name: generation of transgenic hydra by embryo microinjection
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل هارولد اند ليلى جائزة G. Y. ماذرز لHL ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R24 GM080527) إلى RESCEJ كان زميل ما بعد الدكتوراه NRSA (NIH F32GM9037222) ويدعم حاليا من قبل على جائزة تنمية عالم أبحاث إرشادهم من الوطني معهد للشيخوخة (K01AG04435). نود أن نشكر المراجعين للتعليقات مفيدة.

1. إعداد DNA البلازميد، إبر، وأطباق حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA البلازميد باستخدام طقم ماكسي عالية السرعة أو ميدي وتركيز الحمض النووي إلى 2.5 ملغ / مل باستخدام الإيثانول هطول الأمطار. يجب حل بيليه الحمض النووي في nuclease خالية من الماء منزوع الأيونات. تخزين الحمض النووي في 10-20 مكل في -20 درجة مئوية. (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة من ناقلات المتاحة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل طبق الحقن باستخدام الاغاروز لبناء حوض لعقد الأجنة في 100 × 15 مم طبق بتري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المجهر الشريحة 75 × 50 الزجاج إلى 100 × 15 مم طبق بتري في زاوية. صب حوالي 50 مل من 2٪ الاغاروز ذاب في حيدرة المتوسطة 24 في طبق بيتري. بدلا من ذلك، صب الاغاروز في طبق أولا وتعويم &quot;القالب حقن مكروي الأسماك&quot; على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن عززت agarose، إزالة شريحة زجاجية أو القالب. إذا تم استخدام شريحة زجاجية، وقطع بعيدا الاغاروز الزائد مع بلوخ الحلاقةدي لتشكيل الجدار. صب هيدرا المتوسطة في طبق واستخدامه فورا أو تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. يمكن إعادة استخدام الأطباق حقن إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات: مذكرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط على مجتذب micropipette باستخدام الشروط التالية: حرارة 525، وسحب 75، سرعة 100، والوقت 50. مخزن الإبر عن طريق الضغط عليها في شريط ضيق من الطين في طبق بتري بحيث أنها الموازية التي عقدت في قاع الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير محلول الحقن، والجمع بين 3 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل حل DNA البلازميد مع 2 ميكرولتر من 10٪ الفينول الأحمر. دوامة الحل لفترة قصيرة ثم تدور لمدة 10 دقيقة في السرعة القصوى في microcentrifuge لإزالة أي الجزيئات التي قد تسد إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، مقطع الإبرة بضعة ملليمترات من غيض مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة. ملاحظة: هناك بعض المرونة في الحجم المناسب للمفتوحاجي لأن الضغط يمكن تعديلها في الخطوة 3.3 لاستيعاب هذا الاختلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري بحيث انها تحتجز الإبرة في وضع عمودي مع أسفل الحافة. تحميل إبرة مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن بواسطة pipetting السائل في نهاية الجزء الخلفي من الإبرة. السماح للعمل شعري لسحب الحل في رأس الإبرة. </li></ol> 2. إعداد الأجنة للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على أساس يومي مسح الثقافة سلالة هيدرا AEP عن الاورام الحميدة إنتاج البيض. جمع هذه الاورام الحميدة وتضعها جانبا في طبق منفصل الثقافة. مراعاة هذه الاورام الحميدة كل بضع ساعات خلال اليوم لرصد التقدم المحرز في تشكيل البيض. عندما كسر البيض من خلال الأديم الظاهر والجلوس على حلقة من خلايا الأدمة تراجع انهم مستعدون للحقن 25. ضع هذه الاورام الحميدة في طبق مع عدة هيدرا التي لها الخصيتين لا يقل عن 1 ساعة قبل حقن للسماح للإخصاب. هيدرا &lt;/ EM&gt; الذكور ستفرج الحيوانات المنوية دون أي تلاعب خاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم العثور على الإناث في مستعمرة AEP مع البيض تشكيلها بالكامل، والتي هي حوالي 400 ميكرون في القطر 25، أو 1- إلى 8 خلايا الأجنة المرحلة، أيضا جمع هذه للحقن. حقن فورا الأجنة التي بدأت الانفطار. ملاحظة: ليس من الممكن ان نقول للفرق بين البيض تشكيلها بالكامل وبيضات ملقحة وحيدة الخلية، وبالتالي يجب حضنت هذه مع الذكور قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن، وإزالة معظم الأنسجة الأبوية فوق وتحت الجنين باستخدام مشرط بشفرة # 15. ترك فقط الجنين مع قطعة صغيرة من العمود الجسم المرفقة، لاستخدامها لمعالجة الجنين بالملقط إذا لزم الأمر. ملاحظة: الأنسجة التي يتم تشريح بعيدا عن الجنين وتجديد ويجب حفظ لضمان أن الإناث تبقى في مستعمرة هيدرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور، نقل الأجنة إلى طبق الحقن، وترتيبها موازية لجدارحوض الاغاروز. </li></ol> 3. Microinjection من البلازميد DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب microinjector على الوقوف المغناطيسي الذي يجلس على صفيحة الحديد. جبل حامل الحقن، وهو جزء من microinjector الذي يحمل الإبرة، على micromanipulator عصا التحكم. تركيب مناور عصا التحكم على لوحة الحديد، مع الوقوف المغناطيسي. ضع هذا كله مجموعة المتابعة على الجانب الأيمن من مجهر تشريح ووضع حامل حقن بحيث كان مرئيا في مجال المراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق مع حقن الأجنة تحت المجهر تشريح، الموجهة مثل أن الجدار الرأسي للحوض الاغاروز هو اليسار. ادخال الإبرة في حامل الحقن وخفض رأس الإبرة في المتوسط ​​هيدرا في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحول ببطء مقبض من الحقنة في اتجاه عقارب الساعة حتى تملأ الزيوت المعدنية أعلى الإبرة وجود تدفق مستمر من محلول الحقن لوحظ خروج الإبرة في HYDRوسيلة. إذا كان تيار قوي جدا، وانخفاض الضغط من خلال تحويل مقبض عكس عقارب الساعة. ممارسة هذه الخطوة بشكل روتيني للحصول على ضغط مناسب، والذي يعتمد على حجم الفتحة إبرة (أي كيف كان يثقب الإبرة في الخطوة 1.5). ملاحظة: إذا كان تيار قوي جدا، فإن الجنين لم تنج من الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، حرك طبق حقن بحيث الجنين الأول في وسط الميدان. تحريك الإبرة بحيث أنه لمس أن الجنين. استخدام مياداة مجهرية لاختراق الجنين مع الإبرة. ملاحظة: ستكون الجدار الرأسي للحوض الاغاروز حفاظ على الجنين من يتم دفعها جانبا الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل الحقن لتتدفق الجنين 1 أو 2 ثانية ثم قم بإزالة الإبرة بسرعة. إذا كان الجنين لديه أكثر من خلية واحدة، وضخ كل خلية على حدة. استخدام ملقط لإعادة توجيه الجنين لمحاذاة الخلية التالية مع رأس الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد امبري الأوليتم حقن س، نقل الطبق بحيث الجنين القادم في موضع الحقن وكرر الإجراء. تستمر حتى تم حقن جميع الأجنة. </li></ol> 4. التثقيف والتفقيس من الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل من الأجنة المحقونة في صحن مع قليل من هيدرا التي لها الخصيتين (وهذا هو لضمان أن جميع الأجنة المخصبة). احتضان الأجنة في 18 ° C حاضنة في حين أنها لا تزال مرحلة التطور الجنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الوصول إلى مرحلة بشرة، نقل كل الأجنة لحقن بئر الفردي من 24 لوحة جيدا مليئة هيدرا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة المحقونة لمدة 2 أسابيع في الظلام في 18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة 2 الاسبوع، والتحقق من كل حقن الجنين تحت المجهر تشريح. ملاحظة أي الحالات التي فصل الجنين مرحلة بشرة من قطعة صغيرة من الأنسجة الأبوية وإعادة إحياء النسيج الأبوية. إزالة هذا سليلة مجدد فورا حتى أنه لا ميstaken لفقس البيض الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طبق من الأجنة المحقونة تحت ضوء حوض السمك في RT. تحقق لوحات كل يوم، وجمع سلحفاة صغيرة. سلحفاة صغيرة جديدة سوف تكون بيضاء لأن اللون الوردي نموذجية من الاورام الحميدة هيدرا يأتي من الأرتيميا يأكلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة سلحفاة صغيرة تحت المجهر مضان للكشف عن التحوير التعبير. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

هيدرا يستنسخ بشكل روتيني لاجنسيا، ولكنها تتطلب محفزات البيئية للبدء في إنتاج الأمشاج. لا تعرف جيدا هذه المحفزات لمعظم الأنواع وهيدرا قد تختلف من سلالة إلى سلالة. وهناك عقبة كبيرة في إنتاج المعدلة وراثيا هيدرا هو الحصول على الأجنة على أساس منتظم لأنه ق?...

وقد استخدمت هيدرا لدراسة التجديد، وتشكيل نمط، والخلايا الجذعية لحوالي 250 سنة 2 هيدرا لديها خطة هيئة بسيطة تتألف من ثلاثة الأنساب الخلية: الظهارية الأديمي الظاهر، الأديم الباطن الظهارية، وفراغي. يتكون الجسم أنبوبي من الأدمة والأنساب الظهارية الأديم الباطن، كل منها عبارة عن طبقة خلية واحدة. كافة الخلايا الظهارية في عمود الجسم هي الإنقسامية. عندما نزحوا الخلايا الظهارية في الأطراف 3، ورئيس (الفم ومخالب) في نهاية شفوية أو القدم (القرص القاعدية) في نهاية مجافي الفم، فإنها تعتقل في المرحلة G2 من دورة الخلية وتغيير مصير الخلايا 4. خلايا النسب الخلالي يقيمون داخل الفجوات بين الخلايا الظهارية. ويدعم هذا النسب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الموجودة في طبقة الأدمة الظهارية العمود الجسم 5. الخلايا الجذعية الخلالي تؤدي إلى ثلاثة سل الجسديةأنواع ل (الأعصاب، وخلايا الغدة، وnematocytes) والخلايا الجرثومية 6،7. كعضو في بعائلة القراصات، مجموعة شقيقة لجميع bilaterians، يمكن هيدرا تسليط الضوء على العمليات البيولوجية الأساسية المشتركة بين الحيوانات المتعددة الخلايا. حتى وقت قريب، تم عرقلة هذه الجهود من خلال عدم وجود طرق موثوقة لاضطراب في وظيفة الجين. ومع ذلك، مع تطوير منهجية المعدلة وراثيا 1، ونحن الآن قادرون على الاستفادة الكاملة من هيدرا للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المشتركة بين الحيوانات متعددة الخلايا، مثل وظيفة الخلايا الجذعية، تجديد، والزخرفة. يتم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا هيدرا عن طريق الحقن من DNA البلازميد إلى الأجنة، الأمر الذي يؤدي إلى تكامل عشوائي والتعبير خيالية في تردد كبير من سلحفاة صغيرة. يمكن إنشاء خط مع التعبير موحد في نسب معين عن طريق الإكثار اللاجنسي. القدرة على نشر clonally transgشبكة naric هيدرا خطوط هي ميزة على معظم النماذج الحيوانية، والتي يمكن نشرها إلا عن طريق التكاثر الجنسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع الخلايا المعدلة وراثيا بسهولة في الجسم الحي بسبب شفافية الحيوان وغياب البروتينات الفلورية الذاتية 8. في سبع سنوات منذ أول خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تم إجراؤها 1، وقد تم استخدام هذه الخطوط لمجموعة متنوعة من التطبيقات. جعلت التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع مختلفة من الخلايا من الممكن لتتبع حركة الخلية، ومراقبة التغيرات في شكل الخلية، وتتبع مصائر خلية في كل الظروف نوع البرية وبعد اضطراب كيميائي 1،5،9-12. بالإضافة إلى ذلك، التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة في مختلف الأنساب يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزل السكان خلية معينة. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل من mRNAs محددة الخلايا الجذعية ونسب محددة الرنا 13،14 صغيرة. بينما مروجيواحد من اثنين هيدرا الجينات الأكتين وقد استخدم على نطاق واسع، وقد تم تحديد عدد قليل خلية من نوع المروجين محددة وتستخدم لدفع التعبير عن GFP المعدلة وراثيا في هيدرا 9،11،15،16. في المستقبل، سوف المروجين الخلية من نوع معين يسمح لمراقبة وجمع أي نوع من الخلايا المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نهج المعدلة وراثيا بنجاح لتحديد العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة تعمل من المروج Wnt3 17. يوفر تطوير أساليب المعدلة وراثيا في هيدرا نهج قوي لاختبار وظيفة الجينات التي التعبير خارج الرحم، overexpression، وضربة قاضية. وقد بذلت الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently، من أجل دراسة كل وظيفة وتوطين الخلوية 18-20. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن دبابيس الشعر RNA في 3&#39;UTR من التحوير GFP يؤدي الى ضربة قاضية من الجينات المستهدفة 21،22. في هذه النهج مطلوب لتحديد GFPوتتبع أنسجة معدلة وراثيا أثناء إنشاء خط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فمن المرجح أن جزيء GFP أن تتدخل في بعض الحالات مع وظيفة البروتين الموسومة. توضح دراسة حديثة أن الجينات هيدرا يمكن ترتيب في تكوين الاوبرون، أي مصنوعة النصوص متعدد المقارين، والتي يتم فصلها بواسطة المهدرجة تقسم بالإضافة زعيم وترجمتها على حدة 23. عن طريق وضع الجينات ترميز البروتين أو دبوس RNA في موقف المنبع من الاوبرون والجين ببروتين في موقف المصب، يمكن للمرء أن تتبع الأنسجة المعدلة وراثيا دون الحاجة لوضع علامة على الجينات التي تشفر البروتين أو RNA القاسي. وقد استخدم هذا الأسلوب لإبداء دبوس RNA في تكوين الاوبرون مع DsRed2 من أجل تحقيق ضربة قاضية الجين 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

إنشاء خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تغذية سلحفاة صغيرة المعدلة وراثيا كل 2-3 أيام مع يرقات الأرتيميا. سلحفاة صغيرة أحيانا لا تأكل لمدة يوم أو اثنين بعد الفقس. فإن بعض سلحفاة صغيرة جديدة تأكل أبدا، وبالتالي لن البقاء على قيد ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

14.0K Views.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Developmental Biology

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Genetics

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 الجينات المعدلة للجنين بوساطة Integrase في ذبابة الفاكهة

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين الحقن المجهري للأجنة ل Transgenesis في ذبابة الفاكهة

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب<em&gt; حيدرة</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

جيل المعدلة وراثيا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب