Die Autoren danken Frau Lourdes Carreon G Tan für ihre Unterstützung bei der Fischzucht. Diese Arbeit wurde von NMBU, Grants-in-Aid der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummer 18H04881 und 18K19323) und Zuschüssen für Grundlagenforschungsprojekte von der Sumitomo Foundation an S.K.

Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegian University of Life Sciences durchgeführt. Experimente mit Gonadeektomie wurden von der norwegischen Behörde für Lebensmittelsicherheit genehmigt (FOTS ID 24305).
HINWEIS: Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen und weiblichen (6-7 Monate alt, Gewicht ca. 0,35 g, Länge ca. 2,7 cm) japanischen Medaka durchgeführt. Das Geschlecht wurde durch Unterscheidung der sekundären Geschlechtsmerkmale, wie größe und Form der Rücken- und Afterflosse, wie in42,47beschrieben bestimmt.
1. Vorbereitung von Instrumenten und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie anästhetische Stammlösung (0,6% Tricain) vor.<ol>
<li>Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).</li>
		<li>1 ml der Tricain-Stammlösung in mehrere 1,5 mL Kunststoffröhrchen verteilen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Auflischerwasser (0,9% NaCl-Lösung) vor, indem Sie 18 g NaCl in 2 l Aquarienwasser geben. Lagern Sie die Lösung bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie die Schnittwerkzeuge vor, indem Sie einen Rasierer diagonal brechen, um einen scharfen Punkt zu erhalten (Abbildung 1A).</li>
	<li>Herstellung einer gerinnungshemmenden Blutlösung (0,05 U/μL Natrium heparin), indem 25 μL Natrium heparin in 500 μL 1x PBS verdünnt werden. Lagern Sie die gerinnungshemmende Lösung bis zum Gebrauch bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Glasnadeln aus einer 90 mm langen Glaskapillare vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Nadelzieher ziehen (Abbildung 1B) gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Der Außendurchmesser der Glasnadel beträgt 1 mm, während der Innendurchmesser 0,6 mm beträgt.</li>
	<li>Bereiten Sie einen 1,5-ml-Kunststoffrohrdeckel vor, indem Sie den Deckel schneiden und ein Loch machen, das zum Außendurchmesser der Nadel passt (Abbildung 1C). Um das Loch zu machen, erhitzen Sie ein Ende der 9 mm Glaskapillar und stechen Sie die erhitzte Glaskapillar durch den Deckel. Alternativ stechen Sie mit einer Nadel durch den Deckel, bis der Durchmesser des Lochs mit der 9-mm-Glaskapillare zusammenpasst.</li>
</ol>2. Gonadektomie
<ol><li>Bereiten Sie 0,02% der Anästhesielösung vor, indem Sie eine Tube Tricain-Brühe (0,6%) in 30 ml Aquarienwasser verdünnen.</li>
	<li>Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich einer ultrafeinen und zwei feinen Heppzette (eine mit relativ breiter Spitze), einer kleinen Schere, einem Nylonfaden und einem Rasierer, wie in Schritt 1.3 beschrieben.</li>
	<li>Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-60 Sekunden in die 0,02% ige Anästhesielösung legen. HINWEIS: Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe und dem Gewicht des Fisches ab und muss angepasst werden. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kann der Fischkörper mit einer Zette sanft eingeklemmt werden. Reagiert der Fisch nicht, kann mit der Gonadektomie begonnen werden.</li>
	<li>Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung heraus und legen Sie den Fisch horizontal auf die Seite, außerhalb des Wassers unter einem Seziermikroskop.</li>
	<li>Ovariektomie (OVX) bei Frauen<ol>
<li>Entfernen Sie eiabgelagerte Eier (Eier, die außerhalb des weiblichen Körpers hängen), falls vorhanden, und kratzen Sie die Schuppen im Schnittbereich (Abbildung 2A).</li>
		<li>Machen Sie vorsichtig einen etwa 2-2,5 mm langen Schnitt zwischen den Rippen, zwischen den Becken- und Afterflossen (Abbildung 2A) mit der Rasierklinge. Dann kneifen Sie vorsichtig den Fischbauch, während Sie die Eierstöcke nach und nach mit einer feinen Zette mit breiter Spitze herausnehmen.</li>
		<li>Schneiden Sie das Ende der Eierstöcke mit einer feinen Zette ab und legen Sie die Eierstöcke beiseite (Abbildung 2B). HINWEIS: Achten Sie darauf, den Eierstocksack möglichst nicht zu brechen. Wenn der Eierstocksack gebrochen ist, entfernen Sie alle Gonadenspuren so vollständig wie möglich, ohne auch nur nicht eisprungende Eier zu hinterlassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Orchidektomie bei Männern<ol>
<li>Machen Sie vorsichtig einen Schnitt zwischen den Rippen über dem Anus (Abbildung 2A) und öffnen Sie den Schnitt langsam mit einer feinen Zette.</li>
		<li>Greifen Sie die Hoden vorsichtig mit der feinen Zinnen und nehmen Sie die Hoden langsam heraus. Schneiden Sie anschließend das Ende der Hoden ab, um die Hoden vollständig zu entfernen (Abbildung 2B). Bei der männlichen Orchidektomie sind alle Präparate bis zum Schnittteil ähnlich wie bei Denbinnen. Beim Greifen der Hoden wird manchmal das Fett erhalten, das den Hoden ähnelt. Nach der Wiederherstellung des Fettes ist es jedoch möglich, die Hoden wieder zu finden (Abbildung 2B). HINWEIS: Sowohl für Männer als auch für Frauen ist es wichtig, die Schnittgröße im Bauch zu minimieren, um übermäßige Schäden zu vermeiden, die zur Mortalität führen können. Manchmal kann der Darm auch durch den Schnitt zusammen mit den Gonaden erscheinen, also stellen Sie sicher, dass sie vor dem Verschluss ordnungsgemäß in den Schnitt zurückgeführt werden. Vorkenntnisse über die Lage der Eierstöcke und Hoden im Medaka-Abdomen sind unerlässlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Nähen Sie den Schnitt ähnlich bei Männchen und Weibchen (Abbildung 3).<ol>
<li>Legen Sie den Nylonfaden neben den Schnittbereich und stechen Sie die Haut von der rechten Seite des Schnitts durch die innere Körperhöhle mit einer ultrafeinen Zette, um den Faden mit einer feinen Zette aufzunehmen (Abbildung 3; 1-2).</li>
		<li>Stechen Sie die Haut von der linken Seite des Schnitts durch die äußere Körperhöhle, um den Faden herauszunehmen ( Abbildung 3; 3-4).</li>
		<li>Schließen Sie die Schnittöffnung und machen Sie zwei Knoten und schneiden Sie den überschüssigen Faden (Abbildung 3; 4-6). HINWEIS: Die Naht muss ausreichend dicht sein, und der verbleibende Faden am Fisch muss lang genug sein, um eine Lockerung der Naht zu verhindern. Der gesamte Vorgang von der Anästhesie bis zum Nähen dauert in der Regel bis zu 6 Minuten. Längere Zeit kann zur Sterblichkeit führen.</li>
		<li>Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten. HINWEIS: Gonadectomisierte Fische zeigen normalerweise nach 1-2 Stunden im Erholungswasser ein normales Verhalten. Daher kann man je nach Versuchszweck den Fisch nach diesem Zeitintervall beproben.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Blutentnahmeverfahren
<ol><li>Bereiten Sie die Werkzeuge vor: eine Glasnadel, eine Silikonkapillare, ein Kunststoffröhrchen mit einem Loch, ein leeres 1,5-ml-Kunststoffrohr, eine Minizentrifuge und Klebeband.</li>
	<li>Betäuben Sie den Fisch mit einer 0,02%igen Anästhesielösung wie in Schritt 2.1 beschrieben und legen Sie den Fisch unter ein Dissektionsmikroskop in vertikaler Position (Abbildung 4A). Legen Sie den Fisch auf eine helle Oberfläche, um die Visualisierung der kaudalen Punktionsvene zu erleichtern.</li>
	<li>Installieren Sie das Blutentnahmeband, indem Sie eine Glasnadel an der Silikonkapillare befestigen (Abbildung 4B). Brechen Sie die Nadelspitze mit einer breiten Spitzenzette und beschichten Sie die Innenseite der Nadel mit gerinnungshemmender Lösung durch Absaugen und Blasen. HINWEIS: Die Verwendung eines Saugers und einer Silikonkapillare mit einer Länge von mindestens 50 cm wird für Sicherheitsmaßnahmen empfohlen, um einen direkten Kontakt des Blutes beim Absaugen zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Öffnung der Nadelspitze ausreichend groß ist, um das Blut zu ziehen.</li>
	<li>Richten Sie die Nadel auf den Stielbereich des Fisches, zielen Sie auf die Schwanzstielvene (Abbildung 5A) und ziehen Sie das Blut mit dem Mund, bis mindestens ein Viertel des Gesamtvolumens der Nadel gefüllt ist (Abbildung 5B). HINWEIS: Es ist wichtig, das Absaugen zu stoppen, bevor Sie die Nadel aus dem Fischkörper entfernen.</li>
	<li>Lassen Sie die Nadel los und legen Sie ein Stück Klebeband in die Nähe der scharfen Seite der Nadel. Setzen Sie den Deckel mit einem Loch auf ein Auffangrohr und stecken Sie die Nadel in das Rohr durch das Loch mit der Nadelspitze an der Außenseite (Abbildung 5C).</li>
	<li>Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten. HINWEIS: Um eine zweite Blutentnahme von demselben Fisch durchzuführen, entnehmen Sie das Blut eine Woche nach der ersten Blutentnahme.</li>
	<li>Flash Spin das gesammelte Blut für 1-2 Sekunden mit 1.000 x g bei Raumtemperatur, um das Blut in der Röhre zu sammeln.</li>
	<li>Fahren Sie direkt mit den nachgeschalteten Anwendungen fort oder lagern Sie das Blut bis zur Verwendung bei -20 °C. HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die vorherige Studie für die Extraktion von Sexualsteroiden aus dem Vollblut48.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Wie in früheren Literaturliteratur berichtet, werden Gonadektomie und Blutentnahme seit langem in anderen Modellarten verwendet, um Fragen im Zusammenhang mit der Rolle von Sexualsteroiden bei der Regulierung der BPG-Achse zu untersuchen. Diese Techniken scheinen jedoch nur für größere Tiere geeignet zu sein. In Anbetracht der geringen Größe des häufig verwendeten Teleostmodells, der japanischen Medaka, bieten wir ein detailliertes Protokoll für Gonadektomie und Blutentnahme, das für diese Spezies machbar ist.</...

Bei Wirbeltieren spielen Sexualsteroide, die hauptsächlich von den Gonaden produziert werden, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gehirn-Hypophysen-Gonaden-Achse (BPG) durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen1,2,3,4,5. Darüber hinaus beeinflussen Sexualsteroide die Proliferation und Aktivität von Neuronen im Gehirn6,7,8 und endokrinen Zellen, einschließlich Gonadotropen, in der Hypophyse9,10und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophyse. Trotz relativ guter Kenntnisse bei Säugetieren ist der Mechanismus der BPG-Achsenregulation, der durch Sexualsteroide vermittelt wird, bei Nicht-Säugetierarten weit davon entfernt, verstanden zu werden, was zu einem schlechten Verständnis der evolutionär konservierten Prinzipien führt11. Es gibt immer noch eine begrenzte Anzahl von Studien, die die Rolle von Sexualsteroiden auf die Plastizität von Gehirn und Hypophyse dokumentieren, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Rolle und der Auswirkungen von Sexualsteroiden auf verschiedene Wirbeltierarten erhöht.
Unter den Wirbeltieren sind Teleoste zu mächtigen Modelltieren geworden, die zahlreiche biologische und physiologische Fragen beantworten, einschließlich Stressreaktion12,13, Wachstum14,15, Ernährungsphysiologie16,17 und Fortpflanzung2. Teleosten, bei denen Sexualsteroide hauptsächlich durch Östradiol (E2) bei Weibchen und 11-Ketotestosteron (11-KT) bei Männchen18,19vertreten sind, sind seit langem zuverlässige experimentelle Modelle zur Untersuchung des allgemeinen Prinzips der Fortpflanzung über Arten hinweg. Teleoste zeigen Einzigartigkeit in ihrer Hypothalamus-Hypophysen-Verbindung20,21 und verschiedenen Gonadotropzellen22, die manchmal für die Aufklärung von Regulationsmechanismen geeignet sind. Darüber hinaus bieten Teleoste aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Labor- und Feldexperimente viele Vorteile gegenüber anderen Organismen. Sie sind relativ kostengünstig in der Anschaffung und Wartung23,24. Insbesondere kleine Teleostmodelle wie Zebrafische (Danio rerio) und die japanische Medaka (Oryzias latipes) sind Arten mit sehr hoher Fruchtbarkeit und einem relativ kurzen Lebenszyklus, die eine schnelle Analyse der Genfunktion und Krankheitsmechanismen ermöglichen23, was angesichts der zahlreichen gut entwickelten Protokolle und des genetischen Toolkits, die für diese Arten verfügbar sind, noch größere Vorteile bei der Behandlung einer Vielzahl biologischer und physiologischer Fragen bietet25.
In zahlreichen Studien wurde die Entfernung von Gonaden (Gonadektomie) zusammen mit Blutentnahmetechniken als Methode zur Untersuchung vieler physiologischer Fragen verwendet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Fortpflanzungsphysiologie von Wirbeltieren bei Säugetieren26,27,28,Vögeln 29 und Amphibien30. Obwohl die Gonadeektomie-Wirkung auf die Fortpflanzungsphysiologie alternativ von Sexualsteroidantagonisten wie Tamoxifen und Clomifen nachgeahmt werden kann, scheint die Wirkung der Medikamente aufgrund bimodaler Wirkungen inkonsistent zu sein31,32. Chronische Exposition gegenüber einem Sexualsteroidantagonisten kann zu einer Ovarialvergrößerung führen33,34, die die Beobachtung seiner Auswirkungen für langfristige Zwecke aufgrund eines ungesunden Phänotyps deaktivieren kann. Darüber hinaus ist es unmöglich, ein Erholungsexperiment nach der Behandlung mit Sexualsteroidantagonisten durchzuführen, um die spezifische Wirkung bestimmter Sexualsteroide zu gewährleisten. Zusammen mit diesen oben genannten Punkten wurden andere Kompromisse bei der Verwendung von Sexsteroid-Antagonisten ausführlich überprüft31,32. Daher erscheint die Gonadektomie auch heute noch als eine leistungsfähige Technik, um die Rolle von Sexualsteroiden zu untersuchen.
Während Gonadektomie- und Blutentnahmetechniken bei größeren Arten wie dem Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)35, Dem Blaukopflippfisch (Thalassoma bifasciatum)36, Dornhai (Scyliorhinus canicula)37 und Wels (Heteropneustes fossilis und Clarias bathracus)38,39) relativ einfach durchzuführen sind, stellen sie Herausforderungen dar, wenn sie bei kleinen Fischen als Medaka angewendet werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 weniger machbar und scheint anfällig für übermäßige körperliche Schäden für kleine Fische zu sein. Darüber hinaus ist ein Gonadektomieverfahren, das üblicherweise für größere Fische40 verwendet wird, nicht für kleine Fische geeignet, die eine hohe Präzision erfordern, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Schließlich ist die Blutentnahme aufgrund des begrenzten Zugangs zu Blutgefäßen und der geringen Blutmenge bei diesen Tieren eine Herausforderung. Daher ist ein klares Protokoll, das jeden Schritt der Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Teleost demonstriert, von Bedeutung.
Dieses Protokoll demonstriert die Schrittweisen Verfahren der Gonadektomie, gefolgt von Blutentnahmen in japanischen Medaka, einem kleinen Süßwasserfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Japanische Medaka haben ein sequenziertes Genom, mehrere molekulare und genetische Werkzeuge zur Verfügung25und ein genetisches Geschlechtsbestimmungssystem, das die Untersuchung sexueller Unterschiede ermöglicht, bevor sekundäre Geschlechtsmerkmale oder Gonaden gut entwickelt sind41. Interessanterweise besitzen japanische Medaka verschmolzene Gonaden im Gegensatz zu vielen anderen Teleost-Arten42. Diese beiden Techniken zusammen dauern insgesamt nur 8 Minuten und vervollständigen die Liste der bereits für diese Spezies vorhandenen Videoprotokolle, darunter die Markierung von Blutgefäßen43,Patch-Clamp an Hypophysenabschnitten44 und Gehirnneuronen45und primäre Zellkultur46. Diese Techniken werden es der Forschungsgemeinschaft ermöglichen, die Rolle von Sexualsteroiden in Feedback-Mechanismen sowie die Plastizität von Gehirn und Hypophyse in Zukunft zu untersuchen und besser zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Sexualsteroide, die von den Gonaden produziert werden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophysengewebe und bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung bei allen Wirbeltieren, indem sie dem Gehirn und der Hypophyse Rückmeldung geben. Teleostfische besitzen im Vergleich zu Säugetieren einen höheren Grad an Gewebeplastizität und Variation der Fortpflanzungsstrategien und scheinen nützliche Modelle zu sein, um die Rolle von Sexualsteroiden und die Mechanismen, mit denen sie wirken, zu untersuchen. Die Entfernung der Hauptquelle der Sexualsteroidproduktion durch Gonadektomie zusammen mit Blutentnahme zur Messung des Steroidspiegels ist bei größeren Fischen gut etabliert und ziemlich machbar und ist eine leistungsstarke Technik, um die Rolle und Auswirkungen von Sexualsteroiden zu untersuchen. Diese Techniken werfen jedoch Herausforderungen auf, wenn sie in kleinen Teleostmodellen implementiert werden. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren der Gonadektomie sowohl bei Männern als auch bei weiblichen japanischen Medakas, gefolgt von Blutentnahmen. Diese Protokolle haben sich in Medaka als sehr praktikabel erwiesen, was durch eine hohe Überlebensrate, Sicherheit für die Lebensdauer und den Phänotyp der Fische und Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Clearance von Sexualsteroiden angezeigt wird. Die Verwendung dieser Verfahren in Kombination mit den anderen Vorteilen der Verwendung dieses kleinen Teleostmodells wird das Verständnis der Rückkopplungsmechanismen bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung und der Gewebeplastizität von Sexualsteroiden bei Wirbeltieren erheblich verbessern.

Dieses Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Durchführung von Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Modellteletost, dem japanischen Medaka. Die Überlebensrate der Fische nach Ovariektomie (OVX) bei Weibchen beträgt 100% (10 von 10 Fischen), während 94% (17 von 18 Fischen) der Männchen nach orchidektomie überlebten. In der Zwischenzeit, nachdem die Blutentnahme durchgeführt wurde, überlebten alle (38 Fische) Fische.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen.

Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Aufrufe.  Norwegian University of Life Sciences. Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen. 

Serie: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biologie

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Reproduktionstechniken für Diekarianüberwachung und -kontrolle bei Amphibien

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Medikamentöse Behandlung und

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Reproduktionstechniken für Diekarianüberwachung und -kontrolle bei Amphibien