Yazarlar Bayan Lourdes Carreon G Tan'a balık hayvanlığındaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma NMBU, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Hibe-in-Aid (Hibe numarası 18H04881 ve 18K19323) ve Sumitomo Vakfı'ndan S.K.'ye Temel Bilim Araştırma Projeleri için hibe ile finanse edildi.

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,42,47'de açıklandığı gibi, dorsal ve anal yüzgecin büyüklüğü ve şekli gibi ikincil cinsel özellikleri ayırt ederek belirlendi.
1. Enstrümanlar ve çözüm hazırlama
<ol><li>Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (%0,6 Trikain).<ol>
<li>0,6 g Tricaine (MS-222) 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) 100 mL seyreltin.</li>
		<li>Tricaine stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını birkaç 1,5 mL plastik boruya dağıtın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 L akvaryum suyuna 18 g NaCl ekleyerek geri kazanım suyu (%0,9 NaCl çözeltisi) hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Keskin bir nokta elde etmek için bir jilet çapraz kırarak kesi aletlerini hazırlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>25 μL sodyum heparini 500 μL 1x PBS'ye seyrelterek kan pıhtı önleyici çözelti (0,05 U/μL sodyum heparin) hazırlayın. Pıhtı önleyici çözeltiyi kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çekerek(Şekil 1B)cam kılcal damar çekerek 90 mm uzunluğundaki cam kılcal damardan iki cam iğne hazırlayın. NOT: Cam iğnenin dış çapı 1 mm, iç çapı ise 0,6 mm'dir.</li>
	<li>Kapağı keserek 1,5 mL plastik boru kapağı hazırlayın ve iğne dış çapına uygun bir delik açın (Şekil 1C). Deliği açmak için, 9 mm'lik cam kılcal damarın bir ucunun ısıtın ve ısıtılmış cam kılcal damarı kapaktan bıçaklayın. Alternatif olarak, deliğin çapı 9 mm'lik cam kılcal damara sığana kadar kapağı saplamak için bir iğne kullanın.</li>
</ol>2. Gonadektomi prosedürü
<ol><li>30 mL akvaryum suyunda bir tüp Tricaine stoğunu (%0,6) seyrelterek anestezik çözeltinin% 0,02'sini hazırlayın.</li>
	<li>Adım 1.3'te açıklandığı gibi bir ultra ince ve iki ince forseps (biri nispeten geniş uçlu), küçük makas, naylon iplik ve jilet dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın.</li>
	<li>Balığı 30-60 saniye boyunca% 0.02 anestezik çözeltiye koyarak uyuşturun. NOT: Anestezi süresi balığın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlıdır ve uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, balık gövdesi kümesler kullanılarak hafifçe sıkıştırılabilir. Balık tepki vermezse, gonadektomi başlatılabilir.</li>
	<li>Balıkları anestezik çözeltiden çıkar ve balığı yatay olarak yan tarafına, sudan diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.</li>
	<li>Kadınlarda ovaerektomi (OVX)<ol>
<li>Varsa yumurtlama yumurtalarını (dişi vücudun dışına sarkan yumurtalar) çıkarın ve kesi alanındaki pulları kazıyın (Şekil 2A).</li>
		<li>Kaburgalar arasında, pelvik ve anal yüzgeçler arasında ( Şekil 2A ), jilet kullanarak yaklaşık2-2,5mm uzunluğunda bir kesi yapın. Daha sonra, geniş uçlu ince tokmakla yumurtalıkları azar azar çıkarırken balık karnını hafifçe çimdikleyin.</li>
		<li>İnce önlük kullanarak yumurtalıkların ucını kesin ve yumurtalıkları bir kenara yerleştirin (Şekil 2B). NOT: Mümkünse yumurtalık kesesini kırmamaya özenin. Yumurtalık kesesi kırılırsa, yumurtlanmamış yumurta bile bırakmadan gonad izlerini mümkün olduğunca tamamen çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Erkeklerde orkidektomi<ol>
<li>Anüs üzerindeki kaburgalar arasında hafifçe bir kesi yapın (Şekil 2A) ve ince tokmakla kesiği yavaşça açın.</li>
		<li>İnce toksları kullanarak testisleri yavaşça alın ve testisleri yavaşça dışarı alın. Daha sonra testisleri tamamen çıkarmak için testislerin ucunun kesilmesi (Şekil 2B). Erkek orkidektomi için, kesi kısmına kadar tüm preparatlar kadınlarda benzerdir. Testisleri tutarken, bazen testislere benzeyen yağ elde edilir. Bununla birlikte, yağı geri yükledikten sonra testisleri tekrar bulmaya çalışmak mümkündür (Şekil 2B). NOT: Hem erkekler hem de kadınlar için, mortaliteye yol açabilecek aşırı hasarı önlemek için karındaki kesi boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bazen bağırsaklar da gonadlarla birlikte kesiden ortaya çıkabilir, bu nedenle kapanmadan önce kesi içinde düzgün bir şekilde geri döndüklerinden emin olun. Medaka karın bölgesinde yumurtalıklar ve testisler hakkında önceden bilgi sahibi olmak esastır.</li>
	</ol></li>
	<li>Kesiği erkeklerde ve kadınlarda benzer şekilde dikin (Şekil 3).<ol>
<li>Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ince önlüklerle ipliği içeri almak için ultra ince önlük kullanarak derini kesiğin sağ tarafından iç vücut boşluğundan bıçaklayın (Şekil 3; 1-2).</li>
		<li>İpliği çıkarmak için kesiğin sol tarafındaki deriyi dış vücut boşluğundan bıçaklayın ( Şekil 3; 3-4).</li>
		<li>Kesi açıklığını kapatın ve iki düğüm yapın ve aşırı ipliği kesin (Şekil 3; 4-6). NOT: Dikiş yeterince sıkı olmalı ve balık üzerindeki kalan iplik dikişin gevşemesini önleyecek kadar uzun olmalıdır. Anesteziden dikişe kadar tüm işlem genellikle 6 dakika kadar sürer. Daha uzun süre ölüm oranına yol açabilir.</li>
		<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Gonadektomi balıklar genellikle geri kazanım suyunda 1-2 saat sonra normal davranış gösterir. Bu nedenle, deney amacına bağlı olarak, bu zaman aralığından sonra balıkları örnekleyebilirsiniz.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kan örnekleme prosedürü
<ol><li>Aletleri hazırlayın: bir cam iğne, silikon kılcal damar, delikli plastik bir tüp, boş bir 1,5 mL plastik tüp, bir minicentrifuge ve bant.</li>
	<li>2.1. adımda açıklandığı gibi% 0.02 anestezik çözelti kullanarak balığı uyuşturun ve balıkları dikey bir konumda diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 4A). Kaudal delinme damarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için balığı parlak bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Silikon kılcal damara cam iğne takarak kan çekmecesini takın (Şekil 4B). İğnenin ucunu geniş uçlu forsepslerle kırın ve iğnenin içini emiş ve üfleyerek pıhtı önleyici çözelti ile kaplayın. NOT: Emme sırasında kanın doğrudan temasını önlemek için güvenlik önlemleri için enayi ve en az 50 cm uzunluğunda silikon kılcal damar kullanılması önerilir. Ek olarak, iğne ucunun açıklığının kanın çizilmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>İğneyi balığın peduncle bölgesine doğru yönlendirin, kaudal peduncle damarını hedefleyin (Şekil 5A) ve iğnenin toplam hacmi en az dörtte biri dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin (Şekil 5B). NOT: İğneyi balık vücudundan çıkarmadan önce emmeyi durdurmak önemlidir.</li>
	<li>İğneyi bırakın ve iğnenin keskin tarafının yakınlık kısmına bir bant parçası koyun. Kapağı bir toplama tüpüne bir delik ile yerleştirin ve iğneyi tüpün içine, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten geçirin (Şekil 5C).</li>
	<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Aynı balıktan ikinci bir kan örneği almak için, ilk kan örneklemesi yapıldıktan bir hafta sonra kanı örneklemek.</li>
	<li>Flash, tüpteki kanı toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g ile toplanan kanı 1-2 saniye boyunca aşağı çevirin.</li>
	<li>Doğrudan aşağı akış uygulamalarına geçin veya kullanıma kadar kanı -20 °C'de saklayın. NOT: Tüm kandan seks steroid ekstraksiyonu için önceki çalışmaya bakın48.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki literatürde bildirildiği gibi, gonadektomi ve kan örneklemesi uzun zamandır BPG ekseninin düzenlenmesinde seks steroidlerinin rolü ile ilgili soruları araştırmak için diğer model türlerde kullanılmaktadır. Ancak, bu teknikler sadece daha büyük hayvanlar için uygun görünüyor. Yaygın olarak kullanılan teleost modeli Japon medaka'nın küçük boyutunu göz önünde bulundurarak, bu tür için mümkün olan gonadektomi ve kan örneklemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
<p class=...

Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,2,3,4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin6, 7,8ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar11. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.
Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlarhalinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri22, bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispetenucuzdurlar 23,24. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir23, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlarsağlar.
Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,27,28, kuşlar29 ve amfibiler30. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyükbalıklar 40 için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.
Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir25ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi41. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir42. Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesinitamamlayacaktır 43, hipofiz bölümleri44 ve beyin nöronları45ve birincil hücre kültürü46. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, beyin ve hipofiz doku plastisitesinde ve beyin ve hipofiz geri bildirim sağlayarak tüm omurgalılarda üremenin nöroendokrin kontrolünde önemli bir rol oynar. Teleost balıkları, memeliler ile karşılaştırıldığında üreme stratejilerinde daha yüksek derecede doku plastisitesine ve varyasyona sahiptir ve seks steroidlerinin rolünü ve hareket ettikleri mekanizmaları araştırmak için yararlı modeller gibi görünmektedir. Steroid seviyelerini ölçmek için kan örneklemesi ile birlikte gonadektomi kullanarak seks steroid üretiminin ana kaynağının kaldırılması iyi kurulmuş ve daha büyük balık oldukça uygulanabilir olmuştur ve seks steroidlerin rolünü ve etkilerini araştırmak için güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknikler küçük boyutlu teleost modellerinde uygulandığında zorlukları gündeme getirmektedir. Burada, hem erkeklerde hem de dişi Japon medakasında gonadektomi ve ardından kan örneklemesi gibi adım adım yapılan işlemleri açıklıyoruz. Bu protokoller yüksek hayatta kalma oranı, balıkların yaşam süresi ve fenotip için güvenlik ve seks steroid boşluk açısından tekrarlanabilirlik ile belirtilen medaka son derece uygulanabilir olarak gösterilmiştir. Bu prosedürlerin kullanımı, bu küçük teleost modelini kullanmanın diğer avantajları ile birlikte, omurgalılarda cinsiyet steroidleri tarafından sağlanan üreme ve doku plastisitesinin nöroendokrin kontrolünde geri bildirim mekanizmalarının anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirecektir.

Bu protokol, Japon medaka'sı olan küçük boyutlu bir model teleostunda gonadektomi ve kan örneklemesi yapmak için atılan her adımı açıklar. Kadınlarda ovaerektomi (OVX) sonrası balıkların hayatta kalma oranı %100'dür (10 balıktan 10'u), orkideektomi sonrası erkeklerin %94'ü (18 balıktan 17'si) hayatta kalmıştır. Bu arada, kan örnekleme işlemi yapıldıktan sonra, tüm (38 balık) balık hayatta kaldı.
S...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Görüntüleme.  Norwegian University of Life Sciences. Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Medaka Yumurta kullanma Gümüş Nanocolloids tuzluluk bağımlı zehirlilik Deneyi

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Gelişim Biyolojisi

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biyoloji

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Embriyonik Gelişimi İncelemek için Murin Round Spermatid Enjeksiyon Prosedürü

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Anbürlerde Ovaryalı Izleme ve kontrol için üreme teknikleri

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Medaka Yumurta kullanma Gümüş Nanocolloids tuzluluk bağımlı zehirlilik Deneyi

İlaç Tedavi ve

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Anbürlerde Ovaryalı Izleme ve kontrol için üreme teknikleri