Los autores agradecen a la Sra. Lourdes Carreon G Tan su ayuda en la cría de peces. Este trabajo fue financiado por NMBU, Grants-in-Aid de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (número de subvención 18H04881 y 18K19323), y subvención para Proyectos de Investigación en Ciencias Básicas de la Fundación Sumitomo a S.K.

Todas las experimentaciones y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida. Los experimentos con gonadectomía fueron aprobados por la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria (FOTS ID 24305).
NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando machos y hembras adultos (6-7 meses de edad, peso aprox. 0,35 g, longitud aprox. 2,7 cm) medaka japonés. El sexo se determinó distinguiendo las características sexuales secundarias, como el tamaño y la forma de la aleta dorsal y anal, como se describe en42,47.
1. Preparación de instrumentos y soluciones
<ol><li>Preparar solución anestésica stock (0,6% Tricaine).<ol>
<li>Diluir 0,6 g de Tricaína (MS-222) en 100 ml de solución salina tampón de fosfato 10x (PBS).</li>
		<li>Distribuya 1 ml de la solución de material de tricaína en varios tubos de plástico de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare agua de recuperación (solución de NaCl al 0,9%) agregando 18 g de NaCl en 2 L de agua de acuario. Guarde la solución a temperatura ambiente hasta su uso.</li>
	<li>Prepare las herramientas de incisión rompiendo una maquinilla de afeitar en diagonal para obtener un punto afilado(Figura 1A).</li>
	<li>Preparar la solución anticoagulante en sangre (0,05 U/μL de heparina sódica) diluyendo 25 μL de heparina sódica en 500 μL de 1x PBS. Conservar la solución anticoagulante a 4 °C hasta su uso.</li>
	<li>Prepare dos agujas de vidrio de un capilar de vidrio de 90 mm de largo tirando de un capilar de vidrio con un arrancador de agujas(Figura 1B)siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: El diámetro exterior de la aguja de vidrio es de 1 mm, mientras que el diámetro interior es de 0,6 mm.</li>
	<li>Prepare una tapa de tubo de plástico de 1,5 ml cortando la tapa y haga un orificio que encaje con el diámetro exterior de la aguja(Figura 1C). Para hacer el agujero, caliente un extremo del capilar de vidrio de 9 mm y apuñale el capilar de vidrio calentado a través de la tapa. Alternativamente, use una aguja para atravesar la tapa hasta que el diámetro del orificio encaje con el capilar de vidrio de 9 mm.</li>
</ol>2. Procedimiento de gonadectomía
<ol><li>Prepare el 0,02% de la solución anestésica diluyendo un tubo de caldo de Tricaína (0,6%) en 30 ml de agua de acuario.</li>
	<li>Prepare herramientas de disección que incluyan una ultrafina y dos fórceps finas (una con punta relativamente ancha), tijeras pequeñas, hilo de nylon y maquinilla de afeitar como se describe en el paso 1.3.</li>
	<li>Anestesiar el pescado poniéndolo en la solución anestésica al 0,02% durante 30-60 segundos. NOTA: La duración de la anestesia depende del tamaño y peso del pez y debe adaptarse. Para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado, el cuerpo del pez se puede pellizcar suavemente con pinzas. Si el pez no reacciona, se puede iniciar la gonadectomía.</li>
	<li>Saque el pez de la solución anestésica y colóquelo horizontalmente de lado, fuera del agua bajo un microscopio de disección.</li>
	<li>Ovariectomía (OVX) en mujeres<ol>
<li>Retire los huevos ovipositados (huevos que cuelgan fuera del cuerpo femenino) si los hay y raspe las escamas en el área de la incisión(Figura 2A).</li>
		<li>Haga suavemente una incisión de aproximadamente 2-2.5 mm de largo entre las costillas, entre las aletas pélvica y anal(Figura 2A),usando la hoja de afeitar. Luego, pellizca suavemente el abdomen del pez mientras saca los ovarios poco a poco usando pinzas finas con punta ancha.</li>
		<li>Cortar el extremo de los ovarios con fórceps finos y colocar los ovarios a un lado (Figura 2B). NOTA: Tenga cuidado de no romper el saco ovárico si es posible. Si el saco ovárico está roto, elimine cualquier rastro de gónada lo más completamente posible sin dejar incluso óvulos no ovulados.</li>
	</ol></li>
	<li>Orquidectomía en varones<ol>
<li>Haga suavemente una incisión entre las costillas por encima del ano(Figura 2A)y abra la incisión lentamente con fórceps finos.</li>
		<li>Agarre suavemente los testículos con las pórceps finos y saque lentamente los testículos. Posteriormente, corte el extremo de los testículos para eliminar completamente los testículos (Figura 2B). Para la orquidectomía masculina, todas las preparaciones son similares a las de las hembras hasta la parte de la incisión. Al agarrar los testículos, a veces se obtiene la grasa que se asemeja a los testículos. Sin embargo, después de restaurar la grasa, es posible tratar de encontrar los testículos nuevamente (Figura 2B). NOTA: Tanto para hombres como para mujeres, es importante minimizar el tamaño de la incisión en el abdomen para evitar daños excesivos que pueden conducir a la mortalidad. A veces, los intestinos también pueden aparecer a través de la incisión junto con las gónadas, así que asegúrese de que se devuelvan correctamente dentro de la incisión antes del cierre. El conocimiento previo sobre la ubicación de los ovarios y los testículos en el abdomen medaka es esencial.</li>
	</ol></li>
	<li>Suturar la incisión de manera similar en hombres y mujeres(Figura 3).<ol>
<li>Coloque el hilo de nylon al lado del área de la incisión y apuñale la piel desde el lado derecho de la incisión a través de la cavidad interna del cuerpo usando fórceps ultrafinas para tomar el hilo con fórceps finos (Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Apuñalar la piel desde el lado izquierdo de la incisión a través de la cavidad externa del cuerpo para sacar el hilo ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Cierre la abertura de la incisión y haga dos nudos y corte el hilo excesivo (Figura 3; 4-6). NOTA: La sutura debe estar adecuadamente apretada, y el hilo restante en el pez debe ser lo suficientemente largo como para evitar el aflojamiento de la sutura. Todo el procedimiento desde la anestesia hasta la sutura comúnmente toma hasta 6 minutos. Más tiempo puede conducir a la mortalidad.</li>
		<li>Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario. NOTA: Los peces gonadectomizados generalmente muestran un comportamiento normal después de 1-2 horas en el agua de recuperación. Por lo tanto, dependiendo del propósito del experimento, se puede tomar muestras de los peces después de este intervalo de tiempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedimiento de muestreo de sangre
<ol><li>Prepare las herramientas: una aguja de vidrio, un capilar de silicona, un tubo de plástico con un orificio, un tubo de plástico vacío de 1,5 ml, una minicentrífuga y cinta.</li>
	<li>Anestesiar el pescado usando una solución anestésica al 0,02% como se describe en el paso 2.1 y colocar el pez bajo un microscopio de disección en posición vertical(Figura 4A). Coloque el pez sobre una superficie brillante para facilitar la visualización de la vena de punción caudal.</li>
	<li>Instale el cajón de sangre conectando una aguja de vidrio al capilar de silicona (Figura 4B). Rompa la punta de la aguja con pórceps de punta ancha y cubra el interior de la aguja con solución anticoagulante mediante succión y soplado. NOTA: Se recomienda el uso de una ventosa y un capilar de silicona con al menos 50 cm de longitud para medidas de seguridad para evitar cualquier contacto directo de la sangre al succionar. Además, asegúrese de que la abertura de la punta de la aguja sea lo suficientemente grande como para permitir la extracción de sangre.</li>
	<li>Dirija la aguja hacia el área del pedúnculo del pez, apunte a la vena del pedúnculo caudal(Figura 5A)y extraiga la sangre con la boca hasta que se llene al menos una cuarta parte del volumen total de la aguja(Figura 5B). NOTA: Es importante dejar de succiones antes de retirar la aguja del cuerpo del pez.</li>
	<li>Suelte la aguja y coloque un trozo de cinta adhesiva en la proximidad del lado afilado de la aguja. Coloque la tapa con un orificio en un tubo de recolección y coloque la aguja dentro del tubo a través del orificio con la punta de la aguja en el exterior (Figura 5C).</li>
	<li>Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario. NOTA: Para realizar una segunda muestra de sangre del mismo pez, tome muestras de sangre una semana después de la primera muestra de sangre.</li>
	<li>Flash gire hacia abajo la sangre recolectada durante 1-2 segundos con 1,000 x g a temperatura ambiente para recolectar la sangre en el tubo.</li>
	<li>Proceda directamente a las aplicaciones posteriores o almacene la sangre a -20 ° C hasta su uso. NOTA: Consulte el estudio anterior para la extracción de esteroides sexuales de la sangre total48.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se informó en la literatura anterior, la gonadectomía y el muestreo de sangre se han utilizado durante mucho tiempo en otras especies modelo para investigar cuestiones relacionadas con el papel de los esteroides sexuales en la regulación del eje BPG. Sin embargo, estas técnicas parecen ser susceptibles sólo para animales más grandes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del modelo de teleósto comúnmente utilizado, el medaka japonés, proporcionamos un protocolo detallado para la gonadectomía y el muestreo...

En los vertebrados, los esteroides sexuales, que son producidos principalmente por las gónadas, juegan un papel importante en la regulación del eje Cerebro-Hipófisis-Gonadal (BPG) a través de varios mecanismos de retroalimentación1,2,3,4,5. Además, los esteroides sexuales afectan la proliferación y la actividad de las neuronas en el cerebro6,7,8 y las células endocrinas, incluidos los gonadotropos, en la hipófisis9,10,y por lo tanto cumplen funciones cruciales en el cerebro y la plasticidad pituitaria. A pesar de un conocimiento relativamente bueno en mamíferos, el mecanismo de regulación del eje BPG mediado por esteroides sexuales está lejos de ser entendido en especies no mamíferas, lo que lleva a una comprensión deficiente de los principios conservados evolutivamente11. Todavía hay un número limitado de estudios que documentan el papel de los esteroides sexuales en el cerebro y la plasticidad pituitaria, lo que plantea la necesidad de más investigaciones sobre el papel y los efectos de los esteroides sexuales en diversas especies de vertebrados.
Entre los vertebrados, los teleóstos se han convertido en poderosos animales modelo para abordar numerosas preguntas biológicas y fisiológicas, incluida la respuesta al estrés12,13,el crecimiento14,15,la fisiología nutricional16,17 y la reproducción2. Los teleóstomos, en los que los esteroides sexuales están representados principalmente por estradiol (E2) en las hembras y 11-cetotestosterona (11-KT) en los machos18,19,han sido durante mucho tiempo modelos experimentales confiables para investigar el principio general de reproducción en todas las especies. Los teleóstomos muestran singularidad en su conexión hipotalámico-hipofisaria20,21 y distintas células gonadotropas22,que a veces son convenientes para la elucidación de los mecanismos reguladores. Además, debido a su capacidad para experimentos de laboratorio y de campo, los teleóstodos ofrecen muchas ventajas en comparación con otros organismos. Son relativamente baratos de comprar y mantener23,24. En particular, los pequeños modelos de teleósto como el pez cebra(Danio rerio)y el medaka japonés(Oryzias latipes),son especies con una fecundidad muy alta y un ciclo de vida relativamente corto que permite un análisis rápido de la función génica y los mecanismos de la enfermedad23,proporcionando así ventajas aún mayores al abordar una gran cantidad de preguntas biológicas y fisiológicas, teniendo en cuenta los numerosos protocolos bien desarrollados y el conjunto de herramientas genéticas disponibles para estas especies25.
En numerosos estudios, la eliminación de gónadas (gonadectomía) junto con técnicas de muestreo de sangre se han utilizado como método para investigar muchas cuestiones fisiológicas, incluido su impacto en la fisiología reproductiva de vertebrados en mamíferos26,27,28,aves29 y anfibios30. Aunque el efecto de la gonadectomía sobre la fisiología reproductiva puede ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuales, como el tamoxifeno y el clomifeno, el efecto de los fármacos parece ser inconsistente debido a los efectos bimodales31,32. La exposición crónica a un antagonista de esteroides sexuales puede conducir a un agrandamiento ovárico33,34, lo que puede deshabilitar la observación de sus efectos para fines a largo plazo debido a un fenotipo poco saludable. Además, es imposible realizar un experimento de recuperación después del tratamiento con antagonistas de esteroides sexuales, para garantizar el efecto específico de ciertos esteroides sexuales. Junto con esos puntos antes mencionados, otras compensaciones del uso de antagonistas de esteroides sexuales han sido ampliamente revisadas31,32. Por lo tanto, la gonadectomía todavía aparece hoy en día como una técnica poderosa para investigar el papel de los esteroides sexuales.
Si bien las técnicas de gonadectomía y muestreo de sangre son relativamente fáciles de realizar en especies más grandes, como la lubina europea(Dicentrarchus labrax)35,el pez cabeza azul(Thalassoma bifasciatum)36,el cazón(Scyliorhinus canicula)37 y el bagre(Heteropneustes fossilis y Clarias bathracus)38,39,plantean desafíos cuando se aplican en peces pequeños como medaka. Por ejemplo, el uso del Sistema de Administración de Anestesia de Peces (FADS)40 es menos factible y parece ser propenso a daños físicos excesivos para los peces pequeños. Además, un procedimiento de gonadectomía que se usa comúnmente para peces más grandes40 no es adecuado para peces pequeños que requieren alta precisión para evitar daños excesivos. Finalmente, el muestreo de sangre es un desafío debido al acceso limitado a los vasos sanguíneos y la pequeña cantidad de sangre en esos animales. Por lo tanto, es importante un protocolo claro que demuestre cada paso de la gonadectomía y el muestreo de sangre en un pequeño teleósto.
Este protocolo demuestra los procedimientos paso a paso de la gonadectomía seguidos de la toma de muestras de sangre en la medaka japonesa, un pequeño pez de agua dulce nativo del este de Asia. Los medaka japoneses tienen un genoma secuenciado, varias herramientas moleculares y genéticas disponibles25,y un sistema genético de determinación del sexo que permite la investigación de las diferencias sexuales antes de que las características sexuales secundarias o gónadas estén bien desarrolladas41. Curiosamente, los medaka japoneses poseen gónadas fusionadas contrariamente a muchas otras especies de teleóstos42. Estas dos técnicas combinadas toman solo 8 minutos en total y completarán la lista de protocolos de video ya existentes para esta especie que incluyeron el etiquetado de los vasos sanguíneos43,patch-clamp en las secciones hipofisarias44 y neuronas cerebrales45,y el cultivo celular primario46. Estas técnicas permitirán a la comunidad de investigación investigar y comprender mejor los roles de los esteroides sexuales en los mecanismos de retroalimentación, así como la plasticidad cerebral y pituitaria en el futuro.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Los esteroides sexuales, producidos por las gónadas, juegan un papel esencial en la plasticidad del cerebro y el tejido pituitario y en el control neuroendocrino de la reproducción en todos los vertebrados al proporcionar retroalimentación al cerebro y la hipófisis. Los peces teleóstos poseen un mayor grado de plasticidad tisular y variación en las estrategias reproductivas en comparación con los mamíferos y parecen ser modelos útiles para investigar el papel de los esteroides sexuales y los mecanismos por los que actúan. La eliminación de la principal fuente de producción de esteroides sexuales mediante gonadectomía junto con el muestreo de sangre para medir los niveles de esteroides ha sido bien establecida y bastante factible en peces más grandes y es una técnica poderosa para investigar el papel y los efectos de los esteroides sexuales. Sin embargo, estas técnicas plantean desafíos cuando se implementan en modelos de teleósto de tamaño pequeño. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso de la gonadectomía en medaka japonés masculino y femenino seguido de un muestreo de sangre. Estos protocolos han demostrado ser altamente factibles en medaka indicados por una alta tasa de supervivencia, seguridad para la vida útil y el fenotipo de los peces, y reproducibilidad en términos de eliminación de esteroides sexuales. El uso de estos procedimientos combinado con las otras ventajas de usar este pequeño modelo de teleósto mejorará en gran medida la comprensión de los mecanismos de retroalimentación en el control neuroendocrino de la reproducción y la plasticidad tisular proporcionada por los esteroides sexuales en vertebrados.

Este protocolo describe cada paso para realizar gonadectomía y muestreo de sangre en un teleósto modelo de tamaño pequeño, el medaka japonés. La tasa de supervivencia de los peces después de la ovariectomía (OVX) en las hembras es del 100% (10 de cada 10 peces), mientras que el 94% (17 de 18 peces) de los machos sobrevivieron después de la orquidectomía. Mientras tanto, después de que se realizó el procedimiento de muestreo de sangre, todos los peces (38 peces) sobrevivieron.</...

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal.

Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K vistas.  Norwegian University of Life Sciences. El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal. 

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biología

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de espermatida redonda de ratón

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Técnicas Reproductivas para el Monitoreo y Control de La Ovacada en Anfibios

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

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Inyección de espermatida redonda de ratón

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Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

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