Name: salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
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We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Die japanischen Medaka in dieser Studie verwendet wurden, auf humane Weise in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Toyo University, unter Berücksichtigung für die Linderung von Not und Beschwerden behandelt. 1. Silbernanokolloide (SNCs) <ol><li> Bestellen Sie gereinigte SNCs (20 mg / L -1, 99,99% Reinheit, Partikel mittlerer Durchmesser etwa 28,4 ± 8,5 nm in destilliertem Wasser suspendiert). </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration des Silbers durch induktiv gekoppelte Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) analysiert gemäß Betriebsanleitung 8. Das Vorbehandlungsverfahren für ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 2. Herstellung von SNC - Lösungen (Mischungen aus Silber Kolloid- und Ag +) mit unterschiedlichen Salinität <ol><li> Vorbereitung 60 × ERM , bestehend aus 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl 2 · 2H 2 O und 9,78 g MgSO 4 · 7H 2 O in 1 l ultrapure Wasser; den pH - Wert auf 7,0 mit 1,25% NaHCO 3 in Reinstwasser einzustellen. </li><li> Rühren Sie die ERM-Lösung bei 25 ° C über Nacht. </li><li> Mix SNCs mit verdünntem ERM. Bereiten Sie 40 ml jeder SNC-ERM Mischlösung. Die Endkonzentration beträgt 10 mg / L -1 SNCs in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x). </li><li> Der pH - Wert des SNC-ERM gemischte Lösung auf 7,0 mit 0,625% NaHCO 3 in Reinstwasser. pH - Einstellung ist sehr wichtig , die SNC - Lösung bei der Vorbereitung, da Ag + Freisetzung von sauren Bedingungen erleichtert wird 9. </li><li> Verwenden Sie AgNO 3 als Referenzverbindung für SNCs. <ol><li> Mix AgNO 3 mit verdünnter ERM. Vorbereitung 40 ml AgNO 3 -ERM gemischte Lösung bei einer AgNO &amp; sub3 ; -Konzentration von 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 Silber) in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x) . Hinweis: Um die Silberkolloid Toxizität zu untersuchen, AgNO 3Lösung, die eine Quelle von löslichem Silber ist, wird als eine Referenzverbindung für SNCs verwendet, die eine Mischung aus Silberkolloide und lösliches Silber sind. </li></ol></li></ol> 3. Medaka Kultur und Ei Ernte <ol><li> Beziehen Sie die Medaka (O. latipes) (orange-rot - Stamm) (60 Männer und 60 Frauen). </li><li> Kultur Medaka als Gruppen (20 Männer und 20 Frauen als eine Gruppe) in ERM 1x in 3 L Tanks durch einen Medaka Flow-Through-Kultivierungssystem. <ol><li> Kultur unter den folgenden Bedingungen: pH-Bereich des Kulturmediums: 6,2 bis 6,5 Licht: Dunkel-Zyklus: 16: 8 Stunden Temperatur des Kulturmediums: 24 ± 0,5 ° C osmotischen Druck des Kulturmediums 257 mOsm </li></ol></li><li> Feed - Medaka auf Artemia salina Nauplien um 10:00 Uhr (einmal täglich) und Futtermittel einen künstlichen trockenen Fisch Diät um 09:00 Uhr, 11:00, 13:00, 15:00, und 17.00 Uhr (fünf Mal pro Tag). <ol><li> Erhalten A. salina Nauplien. </li> &lt;li&gt; Bereiten 5 L einer 3,0% igen Salzlösung in einem Kunststoffbecher. </li><li> In 30 g Artemia Eier in die Salzlösung in das Becherglas. </li><li> Inkubiere die Eier bei 25 ° C für 48 Stunden mit sprudelnden (4 l / min -1) eine Belüftungspumpe. </li><li> Nach 48 Stunden, die sprudelnden stoppen. </li><li> Lassen Sie die Lösung stehen für 5 bis 10 min die schraffierten A. zu trennen salina Nauplien (unterer Teil der Lösung) von den nicht geschlüpften Eier und Eierschalen (oberer Teil der Lösung). </li><li> Die obere Schicht der Lösung durch Dekantierung. </li><li> Filtern Sie den unteren Teil der Lösung durch ein Sieb mit Öffnungen von 283 &amp; mgr; m, und sammeln Sie die Nauplien, die mit Öffnungen von 198 &amp; mgr; m auf einem Netz passieren. </li><li> Führen Sie die Nauplien zu den Medaka innerhalb von 6 Stunden. </li></ol></li><li> Nachdem die weiblichen Medaka gelaicht haben, entfernen Sie die externe Ei Cluster sanft aus den Körpern der Frauen oder die Eier aus dem Boden des durch die Verwendung eines sm Fischbehälter sammelnalle netto (netto Größe 5 cm x 5 cm, Lochgröße 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Spülen Sie das Ei-Cluster mit Leitungswasser für 5 Sekunden fließt. </li><li> Fügen Sie alle die gespülten Ei-Cluster zu 30x ERM-Lösung. </li><li> Entfernen Sie die Cluster aus der Lösung nach 1 min und legen Sie die Ei-Cluster zwischen trockenen Papierhandtüchern und Rolle vorsichtig. </li><li> Setzen Sie die Eier wieder in den 30x ERM. </li><li> Wählen Sie befruchtete Eier unter einem Binokular. </li><li> Platz ausgewählt 810 Eier in 1x ERM in Sechs-Well-Kunststoffplatten mit einer Pinzette. </li><li> Inkubiere die Eier bei 25 ± 0,1 ° C in einem Inkubator , bis Entwicklungsstadium 21 (Entwicklungsstadien der Medaka - Embryonen aus der Arbeit von Iwamatsu 10 definiert wurden.) </li><li> Suchen Sie sich bebrütete Eier in Entwicklungsstufe 21 unter einem Binokular. </li><li> Spülen Sie ausgewählte Eier mit 1x ERM. </li><li> Betreff der gespülten Eier Belichtungsexperimente (Abschnitt 4). </li></ol> 4. Prüfung der Toxizität von SNCs oder AgNO 3 </sub&gt; Bei verschiedenen ERM Salzhaltigkeiten <ol><li> Spülen Sie Medaka Eier (Stufe 21) dreimal mit Testlösung [SNCs (10 mg / L -1) oder AgNO 3 (15,7 mg / L -1 als 10 mg / L -1 Silber) bei jeder Konzentration von ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x oder) bei pH 7]. Als Kontrollen verwenden Eier in 1 × bis 30 × ERM bei pH 7. </li><li> Liste 15 gespült Eier bis 5 ml jeder Testlösung in Sechs-Well-Kunststoffplatten. (Führen Sie die Belichtungsexperimente dreimal für SNC oder AgNO 3 Toxizität Testen jeder Testlösung verwendet wird .) </li><li> Wickeln Sie die Platten in Aluminiumfolie. </li><li> Inkubieren Sie die gewickelt Platten bei 25 ° C im Dunkeln bis zum Schlüpfen oder für 14 Tage. </li><li> Beachten Sie die exponierten Eier alle 24 Stunden für biologische Veränderungen und tote Eier (Abbildungen 1 und 2). </li><li> Tauschen Sie den Prüflösungen alle 24 Stunden. </li><li> Führen Sie Beobachtungen wie folgt. <ol><li> Am 6. Tag der Exposition, zählen die Herzfrequenz (je 15 sec) of Medaka - Embryonen unter einem Präpariermikroskop mit einer Stoppuhr (Abbildung 3a) verwendet wird . </li><li> Am 6. Tag der Exposition, messen die Augengröße (Durchmesser) von Medaka - Embryonen unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3b) verwendet wird . </li><li> Auf dem Schlüpfen Tag, messen die volle Körperlängen von Larven unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3c) verwendet wird . </li><li> Zählen Sie die Gesamtzahl der exponierten Eier , die über den 14 Tagen (Abbildung 3d) schlüpfen. </li></ol></li></ol> 5. Isolierung von löslichen Silber von SNC-Lösung und Silber-Analyse <ol><li> Isolieren lösliches Silber von jeder SNC-Lösung (eine Mischung aus Silberkolloide und löslichen Silber) durch Filtrieren durch einen 3 kDa-Membranfilter bei 14000 x g und 4 ° C für 10 min. Verwenden Sie ein 3 kDa Membranfilter löslichen Silber aus den SNCs zu isolieren, da der gemeldete mittleren Durchmesser von aggregierten SNCs in ERM 1x 67,8 nm 11 and der von Ag + ist 0,162 nm 12; die 3 kDa Membran schließt Teilchen mit Durchmessern von 2 nm oder mehr 13. </li><li> Messung der Silberkonzentration in 50 &amp; mgr; l filtrierten Lösung (= die löslichen Silberkonzentration) durch ICP-MS - Analyse (Abbildung 3e) nach der ICP-MS - Betriebshandbuch 8. Das Vorbehandlungsverfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 6. Messung der Silber Bioakkumulation in Medaka Embryonen <ol><li> Expose Medaka Eier (Stufe 21) zu SNCs oder AgNO 3 , wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Am Tag 6 der Belichtungs Entfernen Chorion aus dem Ei (dh dechorion) durch in der Medaka Buch 14 beschrieben Medaka Schlüpfen Enzym gemäß dem Protokoll. </li><li> Messung der Silberkonzentration der dechorioned Eier durch ICP-MS - Analyse nach der ICP-MS - Betriebshandbuch 8 (3f). die VorbehandlungsVerfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben. </li></ol> 7. Messung der Silberkonzentration mittels ICP-MS-Analyse <ol><li> In Proben [50 ul Silberlösung (für die Validierung der Silberkonzentration; Teil 1); drei dechorionated Embryonen (Abschnitt 5); oder 50 &amp; mgr; l der gefilterten Lösung (Abschnitt 5)] in ein 50 ml Teflonbecher. </li><li> Werden 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure zu dem 50 ml-Becherglas. </li><li> Das Gemisch wird auf einer Heizplatte bei 110 ° C, bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h). </li><li> Aufzulösen vollständig die organische Substanz, fügen 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure und 0,5 ml Wasserstoffperoxid in das Becherglas. </li><li> Das Gemisch wird wieder auf der heißen Platte bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h). </li><li> Löse den Rückstand in 4 ml 1,0% ultrareine Salpetersäure-Lösung. </li><li> Transfer 4 ml der Lösung in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen 7,6-7,7 zweimal (insgesamt dreimal). Das Endvolumen beträgt 12,0ml. </li><li> Messen Sie die Silberkonzentration der Probe (gelöst in 1,0% Reinst - Salpetersäure) unter Verwendung von ICP-MS - Analyse nach der Betriebsanleitung 8. <ol><li> Verwenden Sie einen internen und einen externen Standardlösung (siehe Materialliste) , um die Silberkonzentration zu quantifizieren. Die internen und externen Standardlösung wird durch American Association for Laboratory Accreditation (A2LA) akkreditiert. Die Nachweisgrenzen von Silber waren 0,0018 ng / ml -1 (Lösung) und 0,016 ng mg-Gewicht -1 (Embryo Körper). </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Medaka ist ein Süßwasserfisch, die sehr tolerant gegenüber Meerwasser ist; es ist nicht bekannt , dass die ursprüngliche natürliche Lebensraum dieser Fisch Salzwasser vor der japanischen Küste 6 war. Daher haben Medakafisches Chloridzellen 7 gut entwickelt. Diese einzigartige Eigenschaft bietet Wissenschaftlern eine neue Möglichkeit, die Toxizität von Chemikalien in der Umwelt als eine Funktion der Salinität (Süßwasser Meerwasser) zu testen, indem nur eine einzige Art von Fisch verwendet...

1 Seit der Gründung der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) Prüfrichtlinien zur Prüfung von Chemikalien im Jahr 1979 wurden 38 Testrichtlinien wurden in Abschnitt 2 der Leitlinien, Auswirkungen auf biotische Systeme veröffentlicht. Alle von den Wasserorganismen wurden aus Süßwasserhabitaten getestet, nämlich Süßwasserpflanzen; Algen; wirbellose Tiere wie Daphnien und Chironomiden; und Fische wie Medaka, Zebrafisch und Regenbogenforelle. Im Vergleich zu Salzwasser-Umgebungen, Süßwasser-Umgebungen mehr direkt durch menschliche wirtschaftlichen und industriellen Tätigkeiten betroffen. Daher Süßwasser-Umgebungen wurden für den Test priorisiert, weil sie ein höheres Risiko von Verschmutzung sind. In den Küstengebieten, einschließlich der Mündungen, variieren Salinität zwischen Brackwasser und Meerwasser Bedingungen, und diese Bereiche werden oft durch industrielle Tätigkeit 2 belastet. Die Küstengebiete und ihre zugehörigen Feuchtgebiete werden durch h gekennzeichnetigh ökologische Artenvielfalt und Produktivität. Küstenökosysteme müssen daher durch chemische Verschmutzung geschützt werden. Allerdings gibt wurde in Brackwasser und Meerwasser Lebensräume ökotoxikologische Forschung beschränkt. Sakaizumi 3 untersucht die toxischen Wechselwirkungen zwischen Methylquecksilber und Salzgehalt in der japanischen Medaka Eier und festgestellt , dass der osmotische Druck der Testlösung eine Erhöhung der Toxizität des Methylquecksilber verbessert. . Sumitani et al 4 verwendet Medaka Eier die Toxizität von Deponiesickerwasser zu untersuchen; sie fanden heraus, dass der osmotische Äquivalenz von Sickerwasser auf die Eier der Schlüssel zu induzieren Anomalien während der Embryonalentwicklung war. Darüber hinaus Kashiwada 5 berichtet , dass Kunststoff - Nanopartikel (39,4 nm Durchmesser) leicht durch das Medaka - Ei Chorion unter Brack Bedingungen durch (15x Embryo Aufzuchtmedium (ERM)). Ein typischer kleiner Fisch - Modell, die japanischen Medaka (Oryzias latipes </em&gt;) hat in grundlegende Biologie und Ökotoxikologie 6 verwendet. Japanische Medaka kann unter den Bedingungen im Bereich von Süßwasser Meerwasser leben wegen ihrer hoch entwickelten Chloridzellen 7. Sie sind daher geeignet für die Prüfung in Bedingungen mit einem weiten Bereich von Salzkonzentrationen nützlich.

<table><tbody><tr><td>Silver nanocolloids</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;) orange-red strain</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka flow-through culturing system</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii eggs</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>aeration pump</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Artificial dry fish diet</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plastic plates</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stopwatch</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa membrane filter</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml centrifugal-type filter</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Teflon beaker</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>For internal standard</td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>For external standard</td></tr><tr><td>ultrapure nitric acid</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide&amp;nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>for atomic absorption spectrometry</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

Salinität ist ein wichtiges Merkmal der Gewässer. Für Wasserorganismen definiert sie die Lebensräume von Süßwasser, Brackwasser und Meerwasser. Tests der Toxizität von Chemikalien und Bewertungen ihrer ökologischen Risiken für Wasserorganismen sind in Süßwasser, aber die Toxizität von Chemikalien für Wasserorganismen ist abhängig von pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt häufig durchgeführt. Es gibt keine Methode, jedoch zum Testen der Salinität Abhängigkeit von Toxizität für Wasserorganismen. Hier haben wir Medaka (Oryzias latipes) , weil sie an Süßwasser, Brackwasser angepasst werden kann, und Meerwasser. Verschiedene Konzentrationen von Embryo-Aufzuchtmedium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x und 30x) wurden eingesetzt, um die Toxizität von Silber nano-kolloidaler Teilchen (SNCs) zu testen, Eier (1x ERM und 30x WKM Medaka haben osmotischen Druck äquivalent In den Süß- und Meerwasser, beziehungsweise). In Sechs-Well - Kunststoffplatten 15 Medaka - Eier in dreifacher Ausfertigung wurden mit 10 mg / L zu SNCs ausgesetzt und# 8722; 1 in verschiedenen Konzentrationen von ERM bei pH 7 und 25 ° C im Dunkeln. Wir haben ein Binokular und einem Mikrometer auf dem Schlüpfen Tag (Abschnitt 4) Herzfrequenz pro 15 Sekunden und Augen Durchmesser am Tag 6 und voller Körperlänge der Larven zu messen. Die Embryonen wurden bis zum Schlüpfen oder Tag 14 beobachtet; zählten wir dann die Schlupfrate für 14 Tage jeden Tag (Abschnitt 4). Um Silber Akkumulation in Embryonen zu sehen, verwendeten wir induktiv Plasma-Massenspektrometrie gekoppelt mit zunehmender Salinität die Silberkonzentration von Testlösungen (Abschnitt 5) und dechorionated Embryonen (Abschnitt 6) .Die Toxizität der SNCs zu Medaka Embryonen offensichtlich erhöht zu messen. Dieses neue Verfahren ermöglicht es, die Toxizität von Chemikalien in verschiedenen Salzgehalten zu testen.

Die Wirkung der Salinität auf SNC Toxizität war sehr offensichtlich: die Induktion von Deformitäten oder Tod abhängig war Salinität (Abbildungen 1 und 2). Wir maßen phänotypische Biomarker (Herzfrequenz, Augengröße, voller Körperlänge und Schlupfrate) in SNC (10 mg / L -1) -exposed Embryonen. Diese phänotypischen Biomarker Salinität abhängige SNC Toxizität ergab. Die ...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Aufrufe.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Serie: Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Zur Beurteilung der akuten Toxizität von Umweltschadstoffen

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Forschung

Umwelt

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Entwicklungsbiologie

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong antimicrobial effects. They also may be released into the environment and accumulate in the ocean. Therefore, AgNPs are the major source of Ag contamination, and public awareness of the environmental toxicity of Ag is increasing. Previous studies have demonstrated the bioaccumulation (in producers) and magnification (in consumers/predators) of Ag. Cetaceans, as the apex predators of ocean, may have been negatively affected by the Ag/Ag compounds. Although the concentrations of Ag/Ag compounds in cetacean tissues can be measured by inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS), the use of ICP-MS is limited by its high capital cost and the requirement for tissue storage/preparation. Therefore, an autometallography (AMG) method with an image quantitative analysis by using formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue may be an adjuvant method to localize Ag distribution at the suborgan level and estimate the Ag concentration in cetacean tissues. The AMG positive signals are mainly brown to black granules of various sizes in the cytoplasm of proximal renal tubular epithelium, hepatocytes, and Kupffer cells. Occasionally, some amorphous golden yellow to brown AMG positive signals are noted in the lumen and basement membrane of some proximal renal tubules. The assay for estimating the Ag concentration is named the Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), which is a regression model established by the data from image quantitative analysis of the AMG method and ICP-MS. The use of AMG with CHAA to localize and semi-quantify heavy metals provides a convenient methodology for spatio-temporal and cross-species studies.

A protocol is presented to localize Ag in cetacean liver and kidney tissues by autometallography. Furthermore, a new assay, named the cetacean histological Ag assay (CHAA) is developed to estimate the Ag concentrations in those tissues.

Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal toxicity test is frequently used in regulatory risk assessment of chemicals. In order to achieve high reliability and reproducibility the development of standardized guidelines is vital. For algal toxicity testing, the guidelines require stable and uniform conditions of parameters such as pH, temperature, carbon dioxide levels and light intensity. Nanomaterials and other so-called difficult substances can interfere with light causing a large variation in results obtained hampering their regulatory acceptance. To address these challenges, we have developed LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). The setup utilizes LED illumination from below allowing for a homogenous light distribution and temperature control while also minimizing intra-sample shading. The setup optimizes the sample volume for biomass quantification and does at the same time ensure a sufficient influx of CO2 to support exponential growth of the algae. Additionally, the material of the test containers can be tailored to minimize adsorption and volatilization. When testing colored substances or particle suspensions, the use of LED lights also allows for increasing the light intensity without additional heat generation. The compact design and minimal equipment requirements increase the possibilities for implementation of the LEVITATT in a wide range of laboratories. While compliant with standardized ISO and OECD guidelines for algal toxicity testing, LEVITATT also showed a lower inter-sample variability for two reference substances (3,5-Dicholorophenol and K2Cr2O7) and three nanomaterials (ZnO, CeO2, and BaSO4) compared to Erlenmeyer flasks and microtiter plates.

We demonstrate algal toxicity testing for difficult substances (e.g., colored substances or nanomaterials) using a setup illuminated vertically with an LED.

Ein kleines Setup für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Stoffen

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

Letalität Bioassay mit Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

Chemie

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Biologie

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medizin

Verhaltenstestbatterie zur Bewertung neurotoxischer Wirkungen bei adulten Zebrafischen

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor im Rampenlicht: Bewertung umwelt- und arzneimittelinduzierter Verhaltensänderungen bei adulten Zebrafischen 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien

Medikamentöse Behandlung und

Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe

Ein kleines Setup für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Stoffen

Letalität Bioassay mit Artemia salina L.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank