يشكر المؤلفان السيدة لورد كاريون جي تان على مساعدتها في تربية الأسماك. تم تمويل هذا العمل من قبل NMBU، والمنح في المعونة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (منحة رقم 18H04881 و 18K19323)، ومنحة لمشاريع أبحاث العلوم الأساسية من مؤسسة سوميتومو إلى S.K.

وقد أجريت جميع التجارب والتعامل مع الحيوانات وفقا للتوصيات المتعلقة بالرعاية التجريبية للحيوانات في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة. وقد وافقت الهيئة النرويجية لسلامة الأغذية على التجارب التي استخدمت استئصال الغدد الغذائية (FOTS ID 24305).
ملاحظة: أجريت التجارب باستخدام البالغين الذكور والإناث (6-7 أشهر من العمر، الوزن ca. 0.35 غرام، طول كاليفورنيا 2.7 سم) ميداكا اليابانية. تم تحديد الجنس من خلال التمييز بين الخصائص الجنسية الثانوية ، مثل حجم وشكل الزعنفة الظهرية الشرجية ، كما هو موضح في42،47.
1. إعداد الآلات والحلول
<ol><li>إعداد محلول مخزون مخدر (0.6٪ Tricaine).<ol>
<li>تمييع 0.6 غرام من Tricaine (MS-222) في 100 مل من 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).</li>
		<li>توزيع 1 مل من محلول الأسهم Tricaine في عدة أنابيب بلاستيكية 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد مياه الانتعاش (0.9٪ محلول NaCl) عن طريق إضافة 18 غرام من NaCl إلى 2 لتر من مياه حوض السمك. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.</li>
	<li>إعداد أدوات شق عن طريق كسر حلاقة قطريا للحصول على نقطة حادة (الشكل 1A).</li>
	<li>إعداد محلول مضاد للتخثر في الدم (0.05 U/μL من الهيبارين الصوديوم) عن طريق تخفيف 25 ميكرولتر من الهيبارين الصوديوم إلى 500 ميكرولتر من 1x PBS. تخزين الحل المضادة للتخثر في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>إعداد اثنين من الإبر الزجاجية من الشعرية الزجاج 90 ملم طويلة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية مع سحب إبرة (الشكل 1B) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: القطر الخارجي للابرة الزجاجية هو 1 مم، بينما القطر الداخلي هو 0.6 مم.</li>
	<li>إعداد غطاء أنبوب بلاستيكي 1.5 مل عن طريق قطع الغطاء وجعل ثقب الذي يناسب مع قطر الإبرة الخارجي(الشكل 1C). لجعل الحفرة، والحرارة نهاية واحدة من الشعرية الزجاج 9 ملم وطعن الشعرية الزجاجية ساخنة من خلال الغطاء. بدلا من ذلك، استخدم إبرة للطعن من خلال الغطاء حتى يتناسب قطر الثقب مع الشعيرات الدموية الزجاجية عيار 9 ملم.</li>
</ol>2. إجراء استئصال الغدد
<ol><li>إعداد 0.02٪ من محلول مخدر عن طريق تمييع أنبوب واحد من مخزون Tricaine (0.6٪) في 30 مل من مياه حوض السمك.</li>
	<li>إعداد أدوات تشريح بما في ذلك واحد فائقة الغرامة واثنين من ملقط غرامة (واحد مع طرف واسع نسبيا)، مقص صغير، خيط النايلون وشفرة الحلاقة كما هو موضح في الخطوة 1.3.</li>
	<li>تخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر 0.02٪ لمدة 30-60 ثانية. ملاحظة: مدة التخدير يعتمد على حجم ووزن السمك ويجب أن تتكيف. لضمان تخدير الأسماك بالكامل ، يمكن قرص جسم السمك بلطف باستخدام ملقط. إذا لم تتفاعل الأسماك، يمكن بدء استئصال الغدد.</li>
	<li>إخراج الأسماك من محلول مخدر ووضع الأسماك أفقيا على جانبها، خارج الماء تحت المجهر تشريح.</li>
	<li>استئصال المبيض (OVX) لدى الإناث<ol>
<li>إزالة البيض oviposited (البيض شنقا خارج جسم الأنثى) إن وجدت وكشط المقاييس في منطقة شق (الشكل 2A).</li>
		<li>إجراء شق بلطف حول 2-2.5 مم طويلة بين الأضلاع، بين الحوض والزعانف الشرجية (الشكل 2A)، وذلك باستخدام شفرة الحلاقة. ثم، قرصة بلطف بطن السمكة في حين إخراج المبيضين شيئا فشيئا باستخدام ملقط غرامة مع طرف واسع.</li>
		<li>قطع نهاية المبيضين باستخدام ملقط ناعم ووضع المبيضين جانبا (الشكل 2B). ملاحظة: الحرص على عدم كسر كيس المبيض إذا كان ذلك ممكنا. إذا كان كيس المبيض مكسورا، قم بإزالة أي آثار للغناد قدر الإمكان دون ترك أي بيضات غير مبيضة.</li>
	</ol></li>
	<li>استئصال السحلية عند الذكور<ol>
<li>إجراء شق بلطف بين الأضلاع فوق فتحة العلج (الشكل 2A)، وفتح شق ببطء باستخدام ملقط ناعم.</li>
		<li>الاستيلاء بلطف الخصيات باستخدام ملقط غرامة وتأخذ ببطء من الخصية. بعد ذلك، وقطع نهاية الخصيتين لإزالة الخصيتين تماما (الشكل 2B). بالنسبة لاستئصال السحلية الذكوري ، تشبه جميع الاستعدادات في الإناث حتى الجزء الشق. عند الاستيلاء على الخصيتين، وأحيانا يتم الحصول على الدهون تشبه الخصيتين. ومع ذلك، بعد استعادة الدهون، فمن الممكن في محاولة للعثور على الخصية مرة أخرى(الشكل 2B). ملاحظة: بالنسبة للذكور والإناث على حد سواء، من المهم تقليل حجم الشق في البطن لمنع الضرر المفرط الذي يمكن أن يؤدي إلى الوفاة. في بعض الأحيان قد تظهر الأمعاء أيضا من خلال الشق جنبا إلى جنب مع النواد، لذلك تأكد من إعادتها بشكل صحيح داخل الشق قبل الإغلاق. المعرفة المسبقة على موقع المبيضين والخصيات في البطن ميداكا أمر ضروري.</li>
	</ol></li>
	<li>خياطة شق بالمثل في الذكور والإناث (الشكل 3).<ol>
<li>ضع الخيط النايلون بجانب منطقة شق وطعن الجلد من الجانب الأيمن من شق من خلال تجويف الجسم الداخلي باستخدام ملقط فائقة الدقة لاتخاذ الموضوع في مع ملقط غرامة (الشكل 3;1-2).</li>
		<li>طعن الجلد من الجانب الأيسر من الشق من خلال تجويف الجسم الخارجي لإخراج الخيط ( الشكل 3؛ 3-4).</li>
		<li>إغلاق فتحة شق وجعل عقدة اثنين وقطع الخيط المفرط (الشكل 3; 4-6). ملاحظة: يجب أن تكون الغرزة ضيقة بشكل كاف، ويجب أن يكون الخيط المتبقي على السمك طويلا بما يكفي لمنع تخفيف الغرز. يستغرق الإجراء بأكمله من التخدير حتى الخياطة عادة ما يصل إلى 6 دقائق. وقد يؤدي طول الوقت إلى الوفاة.</li>
		<li>وضع السمك في مياه الانتعاش وتركها لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض. ملاحظة: عادة ما تظهر الأسماك Gonadectomized السلوك الطبيعي بعد 1-2 ساعة في مياه الانتعاش. ولذلك، اعتمادا على الغرض من التجربة، يمكن للمرء أن عينة الأسماك بعد هذا الفاصل الزمني.</li>
	</ol></li>
</ol>3. إجراء أخذ عينات الدم
<ol><li>إعداد الأدوات: إبرة زجاجية، وشعيرات سيليكون، وأنبوب بلاستيكي مع ثقب، وأنبوب بلاستيكي فارغ سعة 1.5 مل، وطارد مركزي صغير وشريط.</li>
	<li>تخدير الأسماك باستخدام محلول مخدر 0.02٪ كما هو موضح في الخطوة 2.1 ووضع السمك تحت مجهر تشريح في وضع عمودي(الشكل 4A). ضع السمك على سطح مشرق لتخفيف التصور الوريد ثقب caudal.</li>
	<li>تثبيت درج الدم عن طريق إرفاق إبرة زجاجية إلى الشعرية السيليكون (الشكل 4B). كسر غيض من الإبرة مع ملقط تلميح واسعة ومعطف داخل الإبرة مع حل مضاد للتخثر عن طريق الشفط وتهب. ملاحظة: ينصح باستخدام مصاصة وشعيرات سيليكون بطول 50 سم على الأقل لتدابير السلامة لتجنب أي اتصال مباشر بالدم عند الشفط. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن فتحة طرف الإبرة كبيرة بما يكفي للسماح بسحب الدم.</li>
	<li>توجيه الإبرة نحو منطقة peduncle من الأسماك، وتهدف إلى الوريد peduncle caudal (الشكل 5A) ورسم الدم باستخدام الفم حتى يتم تعبئة ما لا يقل عن ربع الحجم الإجمالي للابرة (الشكل 5B). ملاحظة: من المهم التوقف عن الشفط قبل إزالة الإبرة من جسم السمك.</li>
	<li>الإفراج عن الإبرة ووضع قطعة من الشريط على مقربة من الجانب الحاد من الإبرة. ضع الغطاء مع ثقب على أنبوب جمع ووضع الإبرة داخل الأنبوب من خلال ثقب مع طرف إبرة على الخارج(الشكل 5C).</li>
	<li>وضع السمك في مياه الانتعاش وتركها لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض. ملاحظة: لإجراء أخذ عينات دم ثانية من نفس السمكة، عينة الدم بعد أسبوع واحد من أخذ عينات الدم الأولى.</li>
	<li>فلاش تدور أسفل الدم التي تم جمعها لمدة 1-2 ثانية مع 1000 × ز في درجة حرارة الغرفة لجمع الدم في الأنبوب.</li>
	<li>انتقل مباشرة إلى تطبيقات المصب أو تخزين الدم في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ملاحظة: الرجوع إلى الدراسة السابقة لاستخراج الستيرويد الجنس من الدم كله48.</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

كما ورد في الأدبيات السابقة, وقد استخدمت منذ فترة طويلة استئصال الغدد المنوية وأخذ عينات الدم في الأنواع النموذجية الأخرى للتحقيق في المسائل المتعلقة بدور المنشطات الجنس في تنظيم محور BPG. ومع ذلك ، يبدو أن هذه التقنيات قابلة فقط للحيوانات الأكبر. وبالنظر إلى صغر حجم نموذج تيليوست الشائع ا?...

في الفقاريات، المنشطات الجنسية، والتي تنتج أساسا من قبل الغدد التناسلية، تلعب أدوارا هامة في تنظيم محور الدماغ- الغدة النخامية-غدد (BPG) من خلال آليات التغذية المرتدة المختلفة1،2،3،4،5. وبالإضافة إلى ذلك، المنشطات الجنس تؤثر على انتشار ونشاط الخلايا العصبية في الدماغ6،7،8 وخلايا الغدد الصماء ، بما في ذلك gonadotropes ، في الغدة النخامية9،10، وبالتالي تخدم أدوارا حاسمة في الدماغ واللدونة النخامية. على الرغم من المعرفة الجيدة نسبيا في الثدييات، وآلية تنظيم محور BPG بوساطة المنشطات الجنس أبعد ما يكون عن أن يفهم في الأنواع غير الثديية، مما يؤدي إلى فهم ضعيف للمبادئ التطورية المحفوظة11. لا يزال هناك عدد محدود من الدراسات التي توثق دور المنشطات الجنسية على اللدونة الدماغ والغدة النخامية, مما يزيد من الحاجة إلى مزيد من التحقيقات في دور وآثار المنشطات الجنسية على الأنواع الفقارية المتنوعة.
من بين الفقاريات، أصبحت teleosts الحيوانات نموذج قوية في معالجة العديد من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، بما في ذلك استجابة الإجهاد12،13،نمو14،15،علم وظائف الأعضاء الغذائية16،17 والتكاثر2. Teleosts, التي يتم تمثيل معظمها المنشطات الجنس من قبل استراديول (E2) في الإناث و 11 كيتوتستوستيرون (11-KT) في الذكور18,19, منذ فترة طويلة نماذج تجريبية موثوق بها للتحقيق في المبدأ العام للتكاثر عبر الأنواع. Teleosts تظهر تفرد في اتصالها تحت المهاد والغدة النخامية20،21 وخلايا gonadotropeمتميزة 22، والتي هي في بعض الأحيان مريحة لتوضيح الآليات التنظيمية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لقدرتها على كل من التجارب المختبرية والميدانية، فإن الخلايا التليوستية توفر مزايا كثيرة مقارنة بالكائنات الحية الأخرى. فهي غير مكلفة نسبيا لشراء وصيانة23،24. على وجه الخصوص، نماذج تيليوست صغيرة مثل حمار وحشي(دانيو ريو)وmedakaاليابانية (Oryzias latipes)،هي الأنواع ذات البراز عالية جدا ودورة حياة قصيرة نسبيا تمكين التحليل السريع لوظيفة الجينات وآليات المرض23،وبالتالي توفير مزايا أكبر في معالجة عدد كبير من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، والنظر في العديد من البروتوكولات المتطورة جيدا والأدوات الوراثية المتاحة لهذه الأنواع25.
في العديد من الدراسات، تم استخدام إزالة الغدد التناسلية (استئصال الغدد التناسلية) جنبا إلى جنب مع تقنيات أخذ عينات الدم كوسيلة للتحقيق في العديد من الأسئلة الفسيولوجية، بما في ذلك تأثيره في فسيولوجيا الإنجاب الفقارية في الثدييات26و27و28والطيور29 والبرمائيات30. على الرغم من أن تأثير استئصال الغدد التناسلية على فسيولوجيا الإنجاب يمكن أن يحاكي بدلا من ذلك من قبل الخصوم الستيرويد الجنس, مثل تاموكسيفين وكلوميفين, تأثير الأدوية ويبدو أن تكون غير متناسقة بسبب آثار ثنائية الوسائط31,32. التعرض المزمن لخصم الستيرويد الجنس قد يؤدي إلى توسيع المبيض33,34, والتي قد تعطيل مراقبة آثاره لأغراض طويلة الأجل بسبب النمط الظاهري غير صحية. وبالإضافة إلى ذلك, فمن المستحيل إجراء تجربة الانتعاش بعد العلاج خصم الستيرويد الجنس, لتبرير تأثير محدد من المنشطات الجنس معينة. جنبا إلى جنب مع تلك النقاط المذكورة أعلاه, المقايضات الأخرى من استخدام خصم الستيرويد الجنس وقد استعرضت على نطاق واسع31,32. لذلك, استئصال الغدد المنوية لا يزال يظهر اليوم كتقنية قوية للتحقيق في دور المنشطات الجنس.
في حين أن تقنيات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم سهلة نسبيا في الأنواع الأكبر ، مثل باس البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax)35، بلوهيد wrasse (Thalassoma bifasciatum)36، الكلب (Scyliorhinus canicula)37 وسمك السلور (Heteropneustes fossilis و Clarias bathracus)38،39، يثيرون التحديات عند تطبيقها في الأسماك الصغيرة كما ميداكا. على سبيل المثال، استخدام نظام توصيل التخدير السمك (FADS)40 هو أقل جدوى ويبدو أن تكون عرضة للتلف البدني المفرط للأسماك الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء استئصال الغدد التي تستخدم عادة لأكبر الأسماك40 ليست مناسبة للأسماك الصغيرة التي تتطلب دقة عالية لتجنب الضرر المفرط. وأخيرا، فإن أخذ عينات الدم يشكل تحديا بسبب محدودية الوصول إلى الأوعية الدموية وكمية الدم الصغيرة في تلك الحيوانات. لذلك ، فإن بروتوكولا واضحا يوضح كل خطوة من خطوات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم في تيليوست صغير أمر مهم.
يوضح هذا البروتوكول الإجراءات التدريجية لاستئصال الغدد الدموية متبوعة بأخذ عينات الدم في ميداكا اليابانية، وهي سمكة صغيرة من أسماك المياه العذبة موطنها شرق آسيا. ميداكا اليابانية لديها الجينوم تسلسل، العديد من الأدوات الجزيئية والجينية المتاحة25،ونظام تحديد الجنس الوراثية التي تسمح للتحقيق في الاختلافات الجنسية قبل الخصائص الجنسية الثانوية أو النواد متطورة41. ومن المثير للاهتمام، تمتلك ميداكا اليابانية النجنات تنصهر خلافا لكثير من الأنواع الأخرى teleost42. هذه التقنيتين مجتمعة يستغرق سوى 8 دقائق في المجموع، وسوف تكمل قائمة بروتوكولات الفيديو الموجودة بالفعل لهذا النوع التي شملت وضع العلامات على الأوعية الدموية43,التصحيح المشبك على أقسام الغدة النخامية44 والخلايا العصبية في الدماغ45, وثقافة الخلايا الأولية46. هذه التقنيات سوف تسمح للمجتمع البحثي للتحقيق وفهم أفضل لأدوار المنشطات الجنس في آليات التغذية المرتدة، فضلا عن اللدونة الدماغ والغدة النخامية في المستقبل.

<table><tbody><tr><td>Glass capilary</td><td></td><td>GD1</td><td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td>P97</td><td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Nylon thread</td><td></td><td>N45VL</td><td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silicone capillary</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich chemistry</td></tr></tbody></table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

المنشطات الجنسية, التي تنتجها الغدد التناسلية, تلعب دورا أساسيا في الدماغ والأنسجة النخامية اللدونة وفي السيطرة العصبية الصماء من التكاثر في جميع الفقاريات من خلال توفير التغذية المرتدة للدماغ والغدة النخامية. تمتلك أسماك تيليوست درجة أعلى من اللدونة النسيجية والاختلاف في استراتيجيات الإنجاب مقارنة بالثدييات ويبدو أنها نماذج مفيدة للتحقيق في دور المنشطات الجنسية والآليات التي تعمل بها. إزالة المصدر الرئيسي لإنتاج الستيرويد الجنس باستخدام استئصال الغدد المنوية جنبا إلى جنب مع أخذ عينات الدم لقياس مستويات الستيرويد وقد راسخة وممكنة إلى حد ما في الأسماك أكبر وتقنية قوية للتحقيق في دور وآثار المنشطات الجنس. ومع ذلك، تثير هذه التقنيات تحديات عند تنفيذها في نماذج تيليوست صغيرة الحجم. هنا، نقوم بوصف الإجراءات خطوة بخطوة لاستئصال الغدد في كل من الذكور والإناث في ميداكا اليابانية تليها أخذ عينات الدم. وتبين أن هذه البروتوكولات ممكنة للغاية في ميداكا التي يشير إليها ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة، والسلامة لمدى الحياة والنمط الظاهري للأسماك، والاستنساخ من حيث إزالة الستيرويد الجنسي. استخدام هذه الإجراءات جنبا إلى جنب مع مزايا أخرى لاستخدام هذا النموذج تيليوست الصغيرة سوف تحسن كثيرا من فهم آليات التغذية المرتدة في السيطرة العصبية الصماء من التكاثر واللدونة الأنسجة التي توفرها المنشطات الجنس في الفقاريات.

يصف هذا البروتوكول كل خطوة لإجراء استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم في تيليوست نموذج صغير الحجم، ميداكا اليابانية. معدل بقاء الأسماك بعد استئصال المبيضين (OVX) في الإناث هو 100٪ (10 من أصل 10 أسماك) في حين نجا 94٪ (17 من أصل 18 سمكة) من الذكور بعد استئصال السحلية. وفي الوقت نفسه،...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

ويصف المقال بروتوكول سريع لgonadectomize وعينة الدم من الأسماك تيليوست الصغيرة، وذلك باستخدام ميداكااليابانية (Oryzias latipes)كنموذج، للتحقيق في دور المنشطات الجنس في فسيولوجيا الحيوان.

إجراءات استئصال الغدد و أخذ عينات الدم في نموذج تيليوست صغير الحجم الياباني ميداكا (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.3K Views.  Norwegian University of Life Sciences. ويصف المقال بروتوكول سريع لgonadectomize وعينة الدم من الأسماك تيليوست الصغيرة، وذلك باستخدام ميداكااليابانية (Oryzias latipes)كنموذج، للتحقيق في دور المنشطات الجنس في فسيولوجيا الحيوان. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

التي تعتمد على ملوحة سمية الفحص من الفضة Nanocolloids عن طريق الميداكا البيض

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

<meta charset="utf8"></head><body>إجراء حقن المنوية المستديرة الفئران لدراسة التطور الجنيني

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>حقن الفأر المستدير Spermatid

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

حقن الفأر المستدير Spermatid

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

التقنيات الإنجابية لرصد المبيض والسيطرة عليه في البرمائيات

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

إجراءات استئصال الغدد و أخذ عينات الدم في نموذج تيليوست صغير الحجم الياباني ميداكا (Oryzias latipes)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التي تعتمد على ملوحة سمية الفحص من الفضة Nanocolloids عن طريق الميداكا البيض

علاج المخدرات و

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

حقن الفأر المستدير Spermatid

حقن الفأر المستدير Spermatid

حقن الفأر المستدير Spermatid

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم

التقنيات الإنجابية لرصد المبيض والسيطرة عليه في البرمائيات