Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Michael Heymann und Frank Siedler für die Herstellung von Silizium-Wafer, Core Facility MPI-B um Hilfe bei der Proteinreinigung und Simon Kretschmer und Leon Harrington für Kommentare auf das Manuskript.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben ein Protokoll beschrieben für die in-vitro- Rekonstruktion des MinCDE Selbstorganisation auf planaren Lipid Bilayer unterstützt und im Lipid Bilayer bedeckt 3D-Strukturen, am Beispiel von stabförmigen PDMS Mikrostrukturen. Um wertvolle Daten aus diesen Proben zu erhalten, sind die wichtigsten Faktoren zur Steuerung Protein und Membran Qualität.
Eiweiß Protein Qualität Masse sollte mittels SDS-PAGE und Massenspektrometrie bestätigt werden. Darüber hinaus sollte überprüft werden, dass Proteine löslich und nicht aggregierten mithilfe von analytischen Gel Filtration oder dynamische Lichtstreuung. Gel-Filtration kann verwendet werden, um aggregierten Bruchteil der Proteine zu entfernen. Sorgfältige pH-Einstellung und die Qualität der zusätzlichen Nukleotiden ist wichtig, wie der Zusatz nicht angepasste oder teilweise abgebauten Nukleotids an Protein Aktien oder selbstorganisierenden Assays ausreichend proteinaktivität, also die Abschaffung zu beseitigen Selbstorganisati on.
Neben Proteinqualität Membran-Qualität ist sehr kritisch und unsachgemäße Membran Formation ist in den meisten Fällen die Ursache für mangelhafte Selbstorganisation und die Herkunft der artifizielle Oberflächenstrukturen.
Wenn Sie das Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es hilfreich, die unterstützten Lipid Bilayer Etikett nach einschließlich beschrifteten Lipide wie Atto-655-SCHMIERE oder DiI an niedrigen molaren Prozentsätze (0,05 %). Dadurch können die Eigenschaften und die Qualität der Membran direkt beurteilt werden. Verwendung von FRAP, kann die Fluidität der Membran beurteilt werden. Darüber hinaus kann man direkt die Qualität des Waschens der SLB, beurteilen, wie entweder es zu viele Bläschen, keine flüssige Membran oder keine Membran sein, wird wenn sie abgewaschen. Die offene Kammer-Ansatz ermöglicht die Membran, gründlich waschen und damit auch zu Bläschen zu entfernen, die auf der Oberfläche der SLB kleben. Wichtigsten Faktoren für den Erhalt der Flüssigkeit und homogene unterstützten Lipid Bilayer sind die Reinigung und Hydrophilie der Auflagefläche und die richtige Größe und Homogenität der SUVs. kann es helfen SUV Größe und Größe Distribution verwenden überprüfen dynamische Lichtstreuung. Engen Größenverteilung empfehlen wir Extrudieren die Vesikel, anstatt ihnen beschallen. Andere Methoden der Reinigung Deckgläsern, z. B. Behandlungen mit starken Basen, grundlegenden Reinigungsmittel oder mit Deckgläsern direkt nach dem Abspülen mit Wasser, können gute Ergebnisse, je nach Anwendung und Lipid Mischung erzielt werden.
Im erste Halbjahr das Protokoll hier vorgestellten, in-vitro- Wiederherstellung auf planaren unterstützten Lipid Bilayer in offenen Kammern hat den Vorteil der Erbringung der Oberfläche zugänglich für optische Microscopies, z. B. TIRF-Mikroskopie30, FRAP Analyse6,34, sowie Oberflächen-Temperaturfühler Techniken wie atomic Force Microscopy26Single-Teilchen. Die große homogene Fläche ermöglicht bessere Statistiken bei definierten Konzentrationen. Außerdem ermöglicht die offene Kammer Ansatz, um Proteinkonzentration und eine schnelle und einfache Zugabe von weiteren Komponenten, daher erlauben um zu titrieren Proteinkonzentration in einem Einkammer-20genau zu kontrollieren. Der Test kann auch durch Zugabe von anderen bakteriellen Divisome Komponenten wie FtsZ22,35, ZipA22 oder chimäres Protein FtsZ-YFP-MTS10,35erweitert werden.
Andere Gruppen haben einen ähnlichen Ansatz Neuaufbau der Min-System in Vitro, aber Verwendung einer Durchflusszelle statt eine offene Kammer17,18,19. Durchflusszellen haben gewisse Vorteile, insbesondere, wenn eine komplett geschlossene 3D-Umgebung benötigten18, den Einfluss der Strömung17,19,23 oder Membran Zusammensetzung23 auf MinCDE Muster ist untersucht, ob Proteinmuster sollen unter Bedingungen19Begrenzung Protein beobachtet werden. Lokale Steuerung der molekularen Konzentration ist jedoch schwieriger. Eiweißbausteinen, besonders Geist, stark an die Membran binden sie erste Begegnung18,19. Nach unserer Erfahrung zeigen die Proteine häufig unspezifische Bindung an Schläuche, Buchten, Spritzen und anderen mikrofluidischen teilen. Daher lokale proteinkonzentrationen von Eingabe Konzentrationen18 unterscheiden und auch über die Länge der Messzelle, was zu einer Vielzahl von verschiedenen Proteinmuster auf der Membran zwischen Einlass und Auslass, wie von anderen19beobachtet variieren.
Die zweite Hälfte des Protokolls hier präsentiert, die in-vitro- Rekonstitution in stabförmigen Mikrostrukturen erneut mit dem offenen Kammer Ansatz auf einem gemusterten Träger fallenden Lipid Bilayer ermöglicht eine einfache Imitation von in Vivo Protein Verhalten Obwohl ist präzise Steuerung über proteinkonzentrationen durch Puffer Entfernung verloren. Beachten Sie, dass weil die Wellenlänge der MinDE ist etwa eine Größenordnung größer in Vitro als in Vivo die stabförmigen Microcompartments sind auch über eine Größenordnung größer (10 x 30 µm) als eine stabförmige E. Coli Zelle.
Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll für die präzise Steuerung aller Bedingungen einschließlich der Proteinkonzentration, Puffer Zusammensetzung und Eigenschaften der Membran. Der Einsatz von 3D strukturierte unterstützt ermöglicht die Reaktion unter räumliche Beengtheit, imitiert in Vivo Verhalten ohne die Notwendigkeit für komplexe Mikrofluidik Geräte untersucht werden.

Räumlich-zeitliche Muster sind unerlässlich in der Natur, Regulierung von komplexen Aufgaben auf der vielzelligen und zellulären Ebene von Morphogenese geregelte Zellteilung1,2. Reaktion-Diffusions-Systeme spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung dieser Muster, aber noch nicht gut verstanden. Ein Paradebeispiel für eine Reaktion-Diffusion-System und dadurch biologische System ist bisher die Escherichia coli MinCDE System3,4,5,6,7. Das MinCDE System schwankt von Zelle Pol Pol der Zelle in E. Coli in der Mitte der Zelle als künftige Gliederung Standort zu bestimmen. Dieses System basiert auf der ATPase Verstand, die ATPase Protein MinE und die Membran als eine räumliche Reaktion Matrix8aktivieren. MinC ist nicht Bestandteil der bildungsmechanismus Muster, aber ist die eigentliche funktionelle Agent: ein Inhibitor der wichtigsten Divisome Protein FtsZ5,6. MinC bindet an Geist und deshalb folgt die Schwingungen führt ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt Protein, das an den Polen der Zelle maximale und minimale in der Mitte der Zelle, ist nur erlaubt FtsZ polymerisieren bei midcell9,10 . Das MinCDE-System ist Teil der größeren Familie von Walker A ATPases, die Schlüssel für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien2, zum Positionieren und den Transport von Protein-komplexe11 und Plasmide12 und für die Regulierung der Zelle Abteilung13 und Chromosom Abtrennung14. Daher die MinCDE-Reaktion-Diffusion-System nicht nur eine archetypische Reaktion-Diffusion-System darstellt, sondern hat auch Aufmerksamkeit wegen ihrer Relevanz für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien.
Funktionellen Detailstudien des MinCDE Systems in Vivo sind kompliziert, da Manipulation der Proteine und gen Löschung führen in der Regel in Zellteilung Mängel. Darüber hinaus ändern die Zusammensetzung der Membran oder die Eigenschaften der Zellflüssigkeit in Vivo ist sehr anspruchsvoll15,16. Änderungen am System und beeinflussende Faktoren sind schwer, umso mehr im komplexen Umfeld der Zelle, zu interpretieren, wenn es in eine wichtige Funktion als Zellteilung gestört ist. Wir und andere haben daher wandte sich an eine in-vitro- Rekonstitution Ansatz, reduziert das System auf seine Kernkomponenten: Geist, MinE, ATP als Energiequelle und die unterstützten Lipid Bilayer als eine Reaktion Matrix6,17, 18. dieser Bottom-Up-Ansatz ermöglicht es, um den Mechanismus der Selbstorganisation in Detail, ohne die Komplexität einer lebenden Zelle zu erforschen. Reisen Oberfläche Proteine Form Wellen6 und andere Arten von Mustern17,19 unter diesen Bedingungen, wenn auch mit einer Wellenlänge, die in der Regel etwa eine Größenordnung größer als in Vivoist. Die Verwendung von eine offene Kammer ermöglicht präzise Kontrolle über alle Aspekte, die Einfluss auf Musterbildung: Protein Konzentrationen6, Protein Eigenschaften20Membran Zusammensetzung10, Puffer Zusammensetzung und ATP-Konzentration 6, sowie die Zugabe von anderen Faktoren wie engstand Agenten21 und anderen Divisome Proteinen22. Im Vergleich dazu die in-vitro- Rekonstitution des MinCDE Systems in eine-Durchflusszelle18,19,23 lässt sich den Einfluss der Strömung17,23, Protein Sonde Begrenzung der Bedingungen19, Membran Zusammensetzung19 und 3D Entbindung18 auf Proteinmuster, aber macht eine genaue Kontrolle der Protein/Komponente Konzentration und sequentielle Komponente zusätzlich viel mehr kompliziert.
Mit diesem offenen Saal, wir auch die Unterstützung der planaren Lipid Bilayer mit denen kann man wie geometrische Grenzen Einfluss Muster Bildung21, ein Phänomen, das vor kurzem Sonde gemustert auch untersucht worden in Vivo mit Hilfe von Bakterien in Mikrostrukturen7geformt. Wir beschäftigten auch dieser Assay zu untersuchen, wie definierte Mutationen in meinem Affekt Musterbildung der System-20. Darüber hinaus wurde das gleiche grundlegende Assay-Format eingesetzt, um zu untersuchen, wie Musterbildung durch Licht, Einführung einer Azobenzol-vernetzt-MinE-Peptid in der Assay und imaging mit TIRF-Mikroskopie24gesteuert werden kann.
Wir fanden, dass um das MinDE-Muster zu replizieren Bildung beobachtet, in Vivo in einer in-vitro- System, Haft Schlüssel war. Mit stabförmigen Microcompartments mit Dimensionen angepasst, um die größere Wellenlänge der MinDE in Vitro (10 x 30 µm), bekleidet mit einem unterstützten Lipid Bilayer erlaubt die Rekonstitution der MinDE Pol zu Pol Schwingungen und Proteinbildung gradient 10,25. In diesem Test sind unterstützten Lipid Bilayer auf einem gemusterten PDMS Substrat hinterlegt, die mehrere hundert Repliken von stabförmigen Microcompartments enthält, die oben offen bleiben. Dadurch kann die Reaktion in eine offene Kammer eingerichtet werden, und anschließend der Puffer wird abgesenkt, um den Rand des Microcompartments, damit die Reaktion auf ein kleines Volumen zu beschränken. Obwohl diese Fächer ein Luftpuffer Interface auf der einen Seite haben und damit keine volle 3D Entbindung durch Membran repräsentieren, ahmte die Proteindynamik in Vivo Schwingungen10,25. Im Vergleich zu 3D Beengtheit, zeigt die sehr ähnliche Ergebnisse18, die offene Mikrostrukturen-Assay ist relativ einfach und leicht zu handhaben und kann auch durchgeführt werden, von Laboratorien, die nicht mit speziellen Mikrofluidik Equipment ausgestattet sind und Reinraum-Einrichtungen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein experimentelles Protokoll für Neuaufbau MinCDE Musterbildung auf Lipid Bilayer in-vitro unterstützt- über eine offene Kammer, die für die Steuerung aller Komponenten und einfachen Zugang durch optische Mikroskopie und mit Minderjährigen erlaubt Modifikationen, ist auch für die Oberfläche-Sonde Techniken26anpassungsfähig. Neben planaren unterstützten Lipid Bilayer, wir auch zeigen, wie Protein Entbindung mit einfachen gemusterten unterstützten Lipid Bilayer auf stabförmige PDMS Mikrostrukturen erzielt. Diese Tests können zwar für das MinCDE-System optimiert auch zu anderen Protein-Systemen übertragen werden, die in ähnlicher Weise mit der Membran, wie FtsZ27 oder eine minimale Aktin Kortex28interagieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Viele Aspekte der grundlegenden räumlich-zeitliche Organisation der Zellen werden durch Reaktion-Diffusion Schriftsysteme geregelt. In-vitro- Wiederherstellung solcher Systeme ermöglicht die detaillierte Studien der ihr zugrunde liegenden Mechanismen, die nicht machbar wäre in-vivo. Hier bieten wir ein Protokoll für die in-vitro- Wiederherstellung des MinCDE Systems von Escherichia coli, die die Zellteilung Septum in der Mitte der Zelle positioniert. Der Test soll nur die notwendigen Komponenten zur Selbstorganisation, nämlich eine Membran, die beiden Proteine Verstand und mir und Energie in Form von ATP liefern. Wir fertigen daher eine offene Reaktionskammer auf einem deckgläschen, auf dem eine unterstützte Lipid Bilayer gebildet wird. Die offene Bauweise der Kammer ermöglicht eine optimale Vorbereitung von Lipid Bilayer und kontrollierte Manipulation der Massen Inhalte. Die beiden Proteine, Verstand und mir, sowie ATP, werden dann in der Bulk-Volumen oberhalb der Membran hinzugefügt. Bildgebung ist durch viele optische Microscopies, als die Gestaltung unterstützt Konfokale, Weitfeld- und TIRF-Mikroskopie gleichermaßen möglich. In einer Abwandlung des Protokolls wird die Lipid-Bilayer auf einem gemusterten Träger auf Zelle-förmigen PDMS Mikrostrukturen, anstelle von Glas gebildet. Senkung der Bulk-Lösung bis zum Rand dieser Abteilungen umschließt die Reaktion in einem kleineren Fach und Grenzen, die es ermöglichen, Nachahmung von in Vivo oszillierende Verhalten bietet. Zusammengenommen, beschreiben wir Protokolle, um das MinCDE-System, sowohl mit als auch ohne räumliche Beengtheit rekonstruieren erlauben Forschern genau steuern alle Aspekte Musterbildung, wie Konzentrationsbereiche und Zugabe von anderen Faktoren beeinflusst oder Proteine und Komplexität der Systeme in einer relativ einfachen Versuchsaufbau systematisch zu erhöhen.

Proteinreinigung nach unserem Protokoll sollte min. Proteine ausreichende Reinheit Ausbeute. Als Referenz bietet Abbildung 1 ein SDS-PAGE-Bild des Geistes, eindringmittel Geist, MinE und MinC gekennzeichnet. Die einzelnen Schritte des Verfahrens durchführen einen MinDE-Selbstorganisation-Assay auf nicht gemustert unterstützten Lipid Bilayer sind in Abbildung 2beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann regelmäßige MinDE Reisen Oberflächenwellen in der Kammer (Abbildung 3) beobachtet werden. Die Wellenlänge kann innerhalb der Kammer leicht variieren, aber im allgemeinen Muster ähnlich aussehen. Die Kanten der Kammer sollte nicht für quantitative Vergleiche verwendet werden, wie Membranen, dass Formular auf den UV-Kleber scheinen andere Eigenschaften als auf dem Glas haben Oberfläche (siehe Abbildung 3). Reisen Oberflächenwellen können analysiert werden, durch die Intensität entlang der Ausbreitungsrichtung (Bild 3 b) auftragen. Während Geist Fluoreszenz Hochebenen ziemlich schnell von der Vorderkante der Welle und sinkt dann scharf an der Hinterkante, MinE Fluoreszenz steigt nahezu linear von der Beginn der MinD-Welle und erreicht sein Maximum nach Geist an der Hinterkante, wo es fällt deutlich6.
Neben Protein-Qualität ist die Qualität der unterstützten Lipid Bilayer kritischsten für eine regelmäßige Selbstorganisation von MinCDE. Einerseits wenn die Membran auch übermäßig gewaschen ist oder die darunter liegende Fläche gereinigt und somit zu stark aufgeladen wurde, können Löcher in der Membran bilden (Abb. 6A, oben). Auf der anderen Seite die Membran wird nicht richtig gewaschen oder die darunter liegende Fläche nicht gereinigt/hydrophilierten, Vesikel werden halten Sie sich an die Membran oder die membranfluidität beeinträchtigt wird (Abbildung 6A, unten). Obwohl nicht so offensichtlich wie bei der Beobachtung der Membran direkt über beschriftete Lipide, diese Probleme auch aus dem Geist-Fluoreszenz-Signal erkannt werden können als Muster nicht regelmäßig sind und die Fluoreszenz in der Maxima ist nicht homogen, sondern enthält "Löcher" oder helle Flecken wie in der mittleren Spalte der Abbildung 6Adargestellt.
Das Verfahren ist für die Selbstorganisation von MinDE in stabförmigen PDMS Mikrostrukturen in Abbildung 4zusammengefasst. Mehreren Protokoll Schritte müssen nicht wiederholt werden, da Proteine und Lipide wiederverwendet werden können. Wie auf Substraten nicht gemustert, das Substrat wird gereinigt und hydrophilierten (durch Plasmareinigung), eine unterstützte Lipid Bilayer sich auf dem PDMS bildet und Selbstorganisation Assay in einem Volumen von 200 µL eingerichtet ist. Um zu überprüfen, dass eine ordnungsgemäße Membran gebildet hat und MinDE selbst, auf der Membran organisiert, sind die Kammern abgebildet. Wenn eine geeignete Membran gebildet worden, MinDE Formen regelmäßig Reisen Oberflächenwellen auf der Oberfläche der PDMS zwischen den einzelnen Mikrostrukturen und auch am unteren Rand der Mikrostrukturen selbst organisiert, wie die Wellen frei können zu bewegen, über die gesamte Membran-bedeckten Oberfläche (Abb. 5A). Nach dem Puffer entfernen sollte die Fläche zwischen den Abteilen keine verbreitende MinDE-Muster (Abbildung 5 b), zeigen, wie es ganz trocken sein sollte. Wenn MinDE Muster noch in Bewegung sind, muss mehr Puffer entfernt werden. Die Proteine sind jetzt in den stabförmigen Microcompartments beschränkt, durch die Membran gekleidete PDMS und auf dem Luftweg auf die obere Schnittstelle (Abbildung 5), in der sie selbst organisieren. Unter diesen Bedingungen können die beiden Proteine Pol zu Pol Schwingungen ausführen, wie in Abbildung 5dargestellt. Wie ein Bruchteil des Geistes und mir immer Membrane-springen, sind auch beim Puffer entfernen, die Konzentrationen nach der Entfernung der Puffer nicht vergleichbare Konzentrationen eingeben. Wegen dieses Effekts variieren die Konzentrationen auch zwischen einzelnen Mikrostrukturen auf der gleichen Deckglas, da sie abhängig von der Position der Muster vor dem Puffer entfernen. Silizium-Wafer-Produktion oder PDMS Formgebung aus der Silizium-Wafer kann unvollständig Mikrostrukturen führen, die für die Analyse (Abb. 6 b) verwendet werden kann. Darüber hinaus aufgrund der Puffer Entfernung Mikrostrukturen könnte während des Prozesses austrocknen und sollte daher von der weiteren Analyse (Abb. 6 b) ausgeschlossen werden. Als Ergebnis zeigt nur einen Bruchteil von Mikrostrukturen in einer Kammer die gewünschten Schwingungen von Pol zu Pol. Um Proteindynamik in die Mikrostrukturen zu analysieren, erhalten Sie eine Glomeruli durch Zeichnen eine Auswahl über die gesamte Struktur (Abb. 5E). Beim MinCDE oszillieren von Pol zu Pol, erscheinen MinC und Geist ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt mit maximaler Konzentration an den Fach-Polen und minimale Konzentration in der Mitte des Fachs (Abbildung 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Abbildung 1: SDS-PAGE zeigt die finalen Produkte von Protein Reinigungen. Seinen Verstand (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60,1 kDa), seine-mRuby3-Geist (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) und seine MinC (28,3 kDa) werden in der Reihenfolge angezeigt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Abbildung 2: Prozess-Flow-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls für eine Selbstorganisation auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer (Schritte 1 bis 6). Gestrichelte Kästchen zeigen an, dass eine der folgenden zwei Optionen zur Reinigung verwendet werden kann. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Abbildung 3: Imaging von MinDE-Assay konfokalen Mikroskopie. A) regelmäßige Min Spirale, von Geschwindigkeit, die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Welle und Intensität Grundstück Messungen erhalten werden können. Konzentrationen verwendet: 0,6 µM MinD (30 % eGFP-Geist), 1,8 µM sein-MinE (30 % seiner-MinE-Alexa647) B) Beispiel normalisierte Intensität Plot für die Region gekennzeichnet in A. C) Überblick über die gesamte Assay Kammer (Maßstabsleiste: 1 mm, gleiche proteinkonzentrationen als siehe oben). Spiralen drehen beide Richtungen sowie Ziel Muster beobachtet werden können. Die vergrößerte Region zeigt Unterschiede zwischen Wellenmuster auf der UV-Kleber. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Abbildung 4: Prozessfluss-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls zur Selbstorganisation in stabförmigen Mikrostrukturen (Schritte 1 bis 5, 7, 8). Graue Kästchen zeigen Schritte aus dem Protokoll auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer wo Produkte wiederverwendet werden können. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für MinDE Muster Bildung in stabförmigen PDMS Microcompartments. (A) MinDE selbst zu organisieren, auf der Oberfläche der PDMS bilden Reisen Oberflächenwellen (MinD 1 µM (30 % EGFP-Geist), 2 µM MinE und 2,5 mM ATP). B) nach der Puffer auf die Höhe der Mikrostrukturen gesenkt wird, stoppt die Selbstorganisation von Protein auf der Ebenen Oberfläche zwischen den Microcompartments. C) Stromlaufplan von einem stabförmigen Microcompartment. D) repräsentative Bilder von MinDE Pol zu Pol Schwingungen nach dem Puffer entfernen. E) Glomeruli der Schwingungen entlang der markierten Linie gezeigt in D). F) Image und Profil der durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Zeitreihen dargestellt in D) klar hervorgeht, das Protein Gefälle, das maximale an Microcompartment Polen und Fach Mitte minimal ist. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Abbildung 6: Beispiele für negative experimentelle Ergebnisse. A) übermäßig gewaschene Membranen akkumulieren Löcher, während suboptimale Vesikel Vorbereitungen und Lipid-Kompositionen zu kleben Bläschen führen. Die beiden mittleren Platten zeigen eine Kombination von Problemen und wie werden sie sichtbar, wenn Min Schwingungen zu beobachten. Membranen wurden beschriftet mit 0,05 % Atto655-SCHMIERE. (Skalieren Bars: 50 µm) B) Oberseite: ausgetrocknet Microcompartments kann verursacht werden durch zu viel Puffer entfernen, oder wenn der Puffer im Laufe der Zeit verdunstet. Bodenplatte: unvollständige Fächer während der Produktion von Wafern oder PDMS Formteil gebildet werden können. (Skalieren Bars: 30 µm) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1: Plasmid-Karte für seinen Verstand. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Plasmid-Karte für seinen EGFP Verstand. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Plasmid-Karte für sein mRuby3 Geist. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 4: Plasmid-Karte für seine MinE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 5: Plasmid-Karte für seine MinC. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 6: CAD-Datei für Silizium-Wafer von stabförmigen Microcompartments. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K Aufrufe.  Max Planck Institute of Biochemistry. Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

Serie: In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biotechnik

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Lichtgesteuerte reversible Proteinstrukturierung auf Lipidmembranen

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor im Rampenlicht: Photoschaltbare Proteinrekrutierung für reversible Musterbildung in künstlichen zellulären Systemen

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen