Wir danken Laurent Limozin, Pierre Dillard und Astrid Wahl für fruchtbare Diskussionen über zelluläre Anwendungen fort. Wir danken auch Frederic Bedu von PLANETE Reinraum für seine Hilfe bei SEM Beobachtungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Europäischen Forschungsrat über Zuschuss Nr 307104 FP / 2007-2013 / ERC finanziert.

1. Reinigung Glasdeckel-Dias und Beobachtungskammern <ol><li> Ordnet die Glasabdeckung Schlitten auf einem mehr Diamagazin aus einem inerten Material wie Polytetrafluorethylen (PTFE). </li><li> Taucht das Fach mit Rutschen und die Beobachtungskammer in einer Tensidlösung (jedes Produkt zu empfehlen für die Reinigung von Quarzküvetten ist geeignet). </li><li> Unter Verwendung eines Ultraschallbades, ultra-beschallen in der Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen Sie 5-mal mit Reinstwasser (18.2 MΩ.cm, 0,059 &amp; mgr; S / cm). </li><li> Ultra-Sonikat in Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen Sie 10-mal mit Reinstwasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 zweimal. </li><li> Speicher in Wasser bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) für bis zu einer Woche. </li></ol> 2. Herstellung von Protein-Nano-Punkte <ol><li> Die Ablagerung von Perlen <ol><li> Deposit die Suspension von Silica-Kügelchen (2% v / v, 70 &amp; mgr; l) tropft auf einem deckel Schieber (24 x 24 mm, Dicke 170 um) mit einer Neigung von 15 Grad gehalten wird. </li><li> Lassen Sie die Suspension für ca. 1 min verteilt, während das Glas alle 15 s um 90 ° Spiegeln. </li><li> Die Flüssigkeit unter Umgebungsbedingungen zu verdampfen. </li><li> Speicher in einem sauberen Glas oder PTFE Kammer bei Umgebungsbedingungen für bis zu 2 Tagen. </li></ol></li><li> Abscheidung von Aluminium <ol><li> Platzieren Sie die Folien (hergestellt in Abschnitt 2.1) in einer Radiofrequenz (RF) Magnetronzerstäubungsgerät 8, auf einem Drehtisch in einer Entfernung von etwa 105 mm aus einer Aluminium (99%): Silizium (1%) vorbei. </li><li> Abpumpen der Beschichtungskammer auf 2,6 x 10 -4 Pa eine Turbomolekularpumpe. Dieser Schritt ist wichtig für die Entfernung von gasförmigen Verunreinigungen möglich. </li><li> Einführung von reiner Argon-Atmosphäre (5N, 99,999%) mit einem Fluss von 10 sccm bei einem Druck von 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; Anmerkung: Der ankommende Argonfluss durch einen Massendurchflussregler und der Prozeßdruck wird überwacht, gesteuert wird, ein Druckmesser verwendet wird. Der Argongasstrom ist kontinuierlich und wird durch ein Gleichgewicht zwischen dem Einlass und Auslass Öffnen der Ventile gesteuert. </li><li> Schalten Sie den HF-Leistungsgenerator. HINWEIS: Hier wird ein typischer Bereich von 400-600 W Hochfrequenzleistung bei 13,56 MHz verwendet wurde. Der HF-Generator ist mit einem Anpassungsnetzwerk in einem kapazitiven Kopplungsmodus Plasma verwendet. Die reflektierte Leistung wird überwacht und minimiert die Netzwerkanpassung verwenden. </li><li> Nachdem das Plasma stabilisiert wird, Sputter für 2 min geschlossen, um den Verschluss zu halten mögliche Verunreinigungen von der Oberfläche des Targets zu entfernen. </li><li> Öffnen des Verschlusses und ermöglichen dem Sputter weiterhin für 60 min Aluminium auf der Glasträger mit einer Dicke von 200 nm abzuscheiden. </li><li> Schneiden Sie die Strömung von Argon, schließen Sie das Torventil die Turbomolekularpumpe aus der Abscheidungskammer und die Entlüftungsöffnung in die Kammer mit reinem n zu isolierenitrogen den Raumdruck zu erhalten. Wiederherstellen der aluminiumbeschichteten Folien. Speicher für bis zu einem Monat in einer sauberen und hermetisch verschlossenen Glas oder PTFE-Box unter Umgebungsbedingungen. </li></ol></li><li> Dampfabscheidung von Organosilan <ol><li> Tauchen Sie die Aluminium-beschichteten Objektträger, hergestellt in Schritt 2.2.6 in Reinstwasser bei Raumtemperatur und ultra-Sonikat für 30 s in einem Ultraschallbad (50 W, 50/60 Hz, zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Deposit 0,5 ml (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) am Boden eines Exsikkators. ACHTUNG: APTES ist ein Organosilan, das leicht verdampft und ist giftig. APTES sollte nur unter einer strömungs Kapuze und mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Setzen Sie die Objektträger aus Glas (hergestellt in 2.3.1) auf einem Keramik-Gitter und im Inneren der Exsikkator. </li><li> Schließen Sie den Exsikkator mit einer Membranpumpe und läuft bei maximaler Leistung für 30 min mit einem niedrigen Vakuum zu erzeugen. </li><li> Schließen Sie das Ventil des Exsikkator und schaltet die Pumpe ab. </li><li> Heizen Sie den Exsikkatorauf etwa 50 ° C für 1 h. </li><li> Öffnen Sie den Exsikkator und sammeln Sie die Dias. </li><li> Übertragung auf ein anderes sauberes Exsikkator zur Lagerung bis zu 48 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C). </li></ol></li><li> Ablagerung der ersten Schicht von Protein - Rinderserumalbumin, markiert mit Biotin (BSA-Biotin) <ol><li> Legen Sie eine der hergestellten Folien in Abschnitt 2.3 auf einem PTFE-Träger. </li><li> Deposit 1 ml 25 ug / ml BSA-Biotin, gelöst in Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C). </li><li> Spülen 10 mal mit PBS. Lagern Sie die Probe für bis zu 24 h bei 4 ° C entfernt von der Lichtquelle. </li></ol></li><li> Die Entfernung der Aluminiummaske <ol><li> Inkubieren den Objektträger in einer Lösung von NaOH in PBS (hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH auf etwa 100 ml PBS pH≈12 zu erhalten) über Nacht bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). VORSICHT. NaOH ist ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Spülen10-mal in Reinstwasser. </li></ol></li></ol> 3. Die Ablagerung von Lipid Bilayer Stützter (SLB) <ol><li> Reinigen des Langmuir-Trog <ol><li> Entfernen des Wassers in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog mit einer Pumpe. </li><li> Reinigen Sie mit einem fusselfreien Vlies Einweg-Handtuch in Chloroform getränkt. VORSICHT. Chloroform ist giftig und soll in einem gut belüfteten Bereich manipuliert werden, mit einer Maske (oder unter einer Strom-Haube) und mit geeigneten Handschuhen. </li><li> Sauber 4mal mit lauwarmem Reinstwasser (40 bis 50 ° C). </li><li> Reinigen Sie mindestens 6 mal mit kaltem Reinstwasser. </li></ol></li><li> Abscheiden der ersten Lipidschicht <ol><li> Platzieren PTFE Tabletts in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog und dann füllt sie mit Reinstwasser. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware der Langmuir Vorrichtung den gemessenen Druck auf 0 mN / m einzustellen. </li><li> Verwenden, um eine gasdichte Glas / Metall-Spritze 30 ul einer 1 mg / ml Lipidlösung abzuscheiden (1, 2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin (DOPC) in Chloroform) auf der Oberfläche des Wassers. Das Chloroform verdampft und die Lipidmoleküle spontan eine Monoschicht bilden. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware der Lipid-Monoschicht durch Schließen der PTFE Barriere bis zum gewünschten Druck (27 mN / m für DOPC) zu komprimieren, erreicht ist. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware des Glasobjektträger in dem Abschnitt mit Hilfe eines motorisiertes Klemme 2.5.2 in das PTFE-Gehäuse bereit zu tauchen. </li><li> Halten der Folie in der Klemme, die senkrecht zu der Luft-Wasser-Grenzfläche. Mit der Steuer-Software es langsam zu erhöhen (15 mm / min) über die Schnittstelle, während einen konstanten Druck auf 27 mN / m gehalten wird. </li><li> In einer trockenen Umgebung entweder für die sofortigen Gebrauch oder für die Speicherung von bis zu 24 h bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li></ol></li><li> Abscheidung der zweiten Lipidschicht <ol><li> Aufrechterhaltung des Oberflächendruckes in dem Langmuir-Trog auf dem gewünschten Wert von 27 mN / m. Komprimieren Sie die Verwendung vonSteuersoftware der Langmuir-Vorrichtung und / oder eine geringe Menge an Lipid fügen den gewünschten Druck zu erreichen. </li><li> Platzieren Sie die Glasobjektträger tragen, die Lipid-Monoschicht, hergestellt in Abschnitt 3.2.6, horizontal auf der Oberfläche des Wassers. Stellen Sie sicher, dass jede Folie über einer PTFE-Schale schwimmt. </li><li> Schieben die Glasobjektträger nach unten, eine Folie zu einem Zeitpunkt, in sein entsprechendes Fach PTFE verwendet PTFE oder Metallpinzette, so dass sie in das Wasser eingetaucht sind. Vermeiden Sie die Folien Kippen während schieben. </li><li> Verwenden PTFE oder Metallpinzette, die PTFE Böden enthalten die Objektträger in einen Kristallisator mit Reinstwasser sicherstellen gefüllt zu übertragen, dass die Schieber nicht der Luft ausgesetzt sind. </li><li> Verwenden PTFE oder Metallpinzette zu übertragen, während unter Wasser arbeiten, ein zweischichtige beschichteten Glasobjektträger in eine Beobachtungskammer. HINWEIS: Die Beobachtungskammer wird unter Wasser in dem Kristallisator gegeben. Die Beobachtungskammer ist nach Maße und besteht aus einem PTFE-Ring mit einer Gummidichtung einesd Stahlgehäuse, die unter Wasser zusammengesetzt werden können, um eine wasserdichte Kammer, deren Bodenfläche der zuvor von dem Glasobjektträger mit der Lipiddoppelschicht beschichtet ist, hergestellt zu machen. </li><li> Schließen die Kammer während sie weiterhin unter Wasser zu arbeiten, und um sicherzustellen, dass ca. 1 ml Wasser wird in der Kammer gefangen. </li><li> Nehmen Sie die zusammengesetzte Kammer aus dem Wasser. Stellen Sie sicher, dass es wasserdicht und leckagefrei. </li><li> Setzen Sie die 1 ml ultrareinem Wasser, die in der Beobachtungskammer mit PBS durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nie frei von Flüssigkeit ist. </li></ol></li><li> SLB Blockierungsschritt <ol><li> Einführung von 100 ug / ml Rinderserumalbumin (BSA) in der Beobachtungskammer die Folie, hergestellt in Abschnitt 3.3.6 und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) enthält. </li><li> Spülen Sie die Bilayer durch Entfernen und Hinzufügen von 500 ul 10-fach PBS. Die Bilayer kann 24 h bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 4. Funktionalisierung mit Liganden <ol><li> Hinzufügen fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Neutravidin (NAV, eine deglykosylierte Version von Avidin nicht bei pH 7 geladen) bei 2 &amp; mgr; g / ml in die Kammer, um die Folie in Abschnitt 3.4.2 für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° hergestellt, enthaltend C). </li><li> Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. </li><li> Hinzufügen biotinylierten anti-CD3 bei 2 ug / ml in die Kammer, um den Schieber in Abschnitt 3.4.2 enthält, hergestellt. Bei Doppel Funktionalisierung des SLB und die Punkte, fügt Fc-ICAM-1 His-Tag bei 5 &amp; mgr; g / mL (hier die Doppelschicht aus DOPC + 1% Nitrilotriessigsäure (NTA) Lipiden hergestellt wird). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul PBS 10mal </li><li> Ersetzen der PBS mit Zellmedium (PBS + 0,1% BSA) durch Zugabe und 500 &amp; mgr; l des Zellmediums 10 mal entfernt wird. </li><li> Lassen Sie 200 ul Zellmedium in der chambeR mit der Folie. </li><li> Platzieren Sie die Kammer für 10 min bei 37 ° C vor der Zugabe von Zellen. </li></ol> 5. Zellablage (Referenz 7 für Details) <ol><li> deponieren vorsichtig 400 ul der Zellsuspension in die Kammer. Inkubieren der Zellen für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Fix die Zelle mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei 37 ° C. Ersetzen des PFA mit PBS durch wiederholte Entfernung und Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS. </li></ol> 6. Beobachtung <ol><li> Proteo-lipidischen Nanomuster und SLB Fluidität <ol><li> Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops dem Bild das Proteinmuster im Auflicht-Fluoreszenz - Modus geeignete Beleuchtungswellenlänge (639 nm) und Filterwürfel (zB hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688). HINWEIS: Die Intensität des Signals kann die Menge an Protein innerhalb und außerhalb des Punktes abzuschätzen quantifiziert werden. Verwenden, um eine geeignete Beleuchtungswellenlänge (330 nm) und Filter Würfel Bild mit der Doppelschicht (BP 365/12, FT 395, LP 397), die mit dunkelen Löchern hell erscheint. </li><li> Verwenden kontinuierliche Fotobleich (CPB) -Technik 13, 15 , um die Diffusionskonstante des Tracers Lipide in der Doppelschicht zu messen. Diese Beobachtung wird vorzugsweise kurz nach der SLB Abscheidung hergestellt. ANMERKUNG: Um die Diffusionskonstante, zwei Parameter gemessen, während CPB Prozess zu quantifizieren: die spezifische Bleichzeit des Farbstoffs (Taut) und die Abklinglänge des Fluoreszenzprofil des Halo um die gebleichte Fläche (Taud) gebildet ist. Die erste ist durch Aufzeichnen der Zeitentwicklung der Fluoreszenzintensität in der Mitte des beleuchteten Feldes während des CPB Verfahrens erhalten. Das zweite ist, die durch Auftragen der Intensitätsprofil am Rand des ausgeleuchteten Zone (gemittelt über 12 Zeilen und 5 Bilder nach dem stationären Zustand erreicht ist) erhalten. Die Kurven sind ausgestattet Taut und Taud zu erhalten. Die Diffusionskonstante wird durch ta gegebenuD 2 / Taut (D = <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die kritischen Schritte in dem oben beschriebenen Protokoll werden zur Bildung der Nano dots Protein verwandt oder der Hinterfüllen des Raumes um die Punkte, die durch einen unterstützten Lipiddoppelschicht. Der erste kritische Schritt in Bezug auf Protein-Nanopunkten ist die Herstellung der Wulstes-Maske. Die Reinigung des Deckelschlitten ist kritisch. Die Folien müssen entweder mit einer Reinigungslösung gereinigt werden, die für die Reinigung von Quarzküvetten, oder mit einem Sauerstoffplasma wird empfohlen. An...

<html> Zelladhäsion erfolgt durch spezialisierte Zelladhäsionsmoleküle (CAMs), Proteine, die auf der Zellmembran, die zu ihrem Gegenstück der Bindung auf der extrazellulären Matrix oder auf einem anderen Zelle fähig sind. Auf adhärierten Zellen, die meisten Adhäsionsmoleküle , einschließlich der allgegenwärtigen Integrin und Cadherin, werden in Form von Clustern 1 gefunden. Die Wechselwirkung von T-Lymphozyten (T-Zellen) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stellt ein besonders treffendes Beispiel für die Bedeutung des Rezeptor-Cluster an der Grenzfläche zwischen den beiden Zellen gebildet - oft eine immunologischen Synapse bezeichnet. Bei der Bildung die erste Berührung mit dem APC, T - Zell - Rezeptoren (TCRs) auf der Oberfläche der T - Zellen - Form micron Skala Cluster , die dazu dienen , als Signalisierungsplattformen 2, 3, 4, und werden schließlich zentralisieren einen größeren zentralen supramolekularen Cluster zu bilden (cSMAC )lass = &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Vor kurzem wurde es , dass auf der APC Seite gezeigt, die Liganden des TCR sind auch 8 gebündelt. Im Zusammenhang mit der T - Zell-APC - Interaktion, die Bereitstellung von Hybrid - Systemen, wo der APC durch eine künstliche Oberfläche funktionalisierte mit relevanten Proteinen nachgeahmt wird, vorgerückt ist unser Verständnis der synaptischen Schnittstelle 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In diesem Zusammenhang ist es höchst relevant APC-Mimetikum Oberflächen zu gestalten, dass ein oder mehr Aspekte der Zielzelle erfassen. Wenn beispielsweise Liganden auf unterstützte Lipiddoppelschichten aufgepfropft werden, können sie in der Ebene der Doppelschicht diffundieren, ahmen die Situation auf der APC Oberfläche und zur gleichen Zeit der Bildung des erlaubencSMAC 6, 7. Ähnlich haben die Cluster auf der APC nachgeahmt von 14 Inseln von Liganden in einem Meer von Polymeren , 9, 10, 11, 12, 13, zu schaffen. Allerdings haben diese beiden Merkmale bisher nicht kombiniert. Hier beschreiben wir eine neuartige Technik Nano-Dots von Anti-CD3 zu erzeugen (ein Antikörper, der den TCR-Komplexes Targets) von einer Lipiddoppelschicht mit diffundierenden Lipiden umgeben. Die Bilayer wird unter Verwendung von Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schäfer - Technik abgeschieden 7, 15, 16 und , falls gewünscht, könnte mit einem bestimmten Protein funktionalisiert werden - beispielsweise der Ligand der T - Zell - Integrin (genannt ICAM1). Darüber hinaus cou die anti-CD3-Protein dotsld mit einem anderen Antikörper oder CAM ersetzt werden. Während wir die Proteine, die für die zukünftige Nutzung als Plattform für die T-Zell-Adhäsion Studien gewählt haben, detailliert die Strategie hier kann für jedes Protein und sogar DNA angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Derzeit gibt es ein beträchtliches Interesse an in einem Meer von passivierten Oberfläche geordnete Anordnungen von Adhäsionsprotein Inseln zu schaffen für zellbiologische Untersuchungen. In den letzten Jahren hat es immer deutlicher, dass lebende Zellen reagieren, nicht nur auf die biochemische Natur der Moleküle ihnen vorgestellt, sondern auch auf die Art, wie diese Moleküle präsentiert werden. Erstellen von Protein Mikromuster wird deshalb jetzt Standard in vielen biologischen Laboratorien; Nanostrukturen sind auch zugänglich. Doch im Zusammenhang mit den Zell-Zell-Interaktionen, besteht ein Bedarf an Mustern nicht nur Proteine, sondern auch Lipid-Doppelschichten. Solche Dual proteo-lipidic Musterung ist bisher nicht leicht zugänglich. Wir bieten eine einfache Technik Protein Nanopunkte auf Glas und schlagen ein Verfahren zu schaffen unterstützten den Zwischenpunktraum mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) verfüllen. Vom Fotobleichen des Tracers enthalten fluoreszierende Lipide im SLB, zeigen wir, dass die Doppelschicht in-pl erhebliche aufweistane Fluidität. Funktionalisierung der Proteinpunkte mit fluoreszierenden Gruppen ermöglicht es uns, Bild sie und zu zeigen, dass sie in einem regelmäßigen hexagonalen Gitter geordnet. Die typische Punktgröße beträgt etwa 800 nm und der Abstand hier gezeigt, ist 2 um. Diese Substrate werden erwartet als nützliche Plattformen für die Zelladhäsion, Migration und mechano-Sensing-Studien dienen.

Die Fluoreszenzbilder wurden analysiert, um den Abstand und die Größe der Punkte zu messen. Typische Abstände wurden gefunden 1.900 ± 80 nm und typischer Punktgrßenauswahlmittel sein betrug 600 ± 100 nm (Figur 1g). Der Abstand wird durch die Größe der Perlen für die Maske verwendet, eingestellt. Die Punktgröße wird durch die sickenGröße sowie Abscheidebedingungen eingestellt. Der SLB ist eindeutig um die Protein - Punkte und nicht auf sie (Figur 2),<...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K Aufrufe.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen. 

Serie: Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Forschung

Biochemie

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Biologie

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biotechnik

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Zusammenfassung

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Zusammenfassung

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie