آثار الشيكونين على مسار إشارات HIF-1α / VEGF في الفئران المصابة بإصابة الرئة الحادة الناجمة عن الإنتان

يهدف البروتوكول إلى تقييم فعالية الشيكونين في التخفيف من إصابات الرئة الحادة الناجمة عن الإنتان في الفئران. من خلال استهداف مسار HIF-1α / VEGF ، تبحث الدراسة في كيفية تأثير الجرعات المختلفة من الشيكونين على معدلات البقاء على قيد الحياة ، وأمراض الرئة ، والتعبير عن علامات الالتهابات ، مما يسلط الضوء على فوائده العلاجية المحتملة.

غالبا ما يسبب الإنتان إصابة الرئة الحادة (ALI) ، وهي مضاعفات عالية الوفيات. يلعب مسار HIF-1α / VEGF دورا رئيسيا في الإنتان ، وقد يخفف الشيكونين ، وهو مركب طبيعي له خصائص مضادة للالتهابات ، من إصابة الرئة من خلال استهداف هذا المسار. تم تقسيم فئران Balb / c بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: مجموعة الوهم ، والمجموعة النموذجية ، ومجموعة العلاج بجرعة منخفضة ، ومجموعة العلاج بجرعات عالية. خضعت المجموعة الوهمية لبضع البطن بدون ربط الرأس والثقب (CLP) ، بينما خضعت المجموعة النموذجية لعملية CLP للحث على إصابة رئوية حادة مرتبطة بالإنتان. وبعد النمذجة، تلقت مجموعات المعالجة ذات الجرعة المنخفضة والجرعة العالية الشيكونين عن طريق التزقيم بجرعات 12.5 ملغم/كغ و50 ملغم/كغ، على التوالي، مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما. تمت مراقبة معدل بقاء الفئران لمدة 7 أيام. تم استخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) لتقييم أمراض أنسجة الرئة ، وتم قياس نسبة الوزن الرطب / الجاف في الرئة (W / D) ، وتم إجراء لطخة غربية للكشف عن التعبير عن HIF-1α و VEGF و TNF-α و IL-6 في أنسجة الرئة. أدى الشيكونين إلى تحسين معدل بقاء الفئران الإنتانية بشكل كبير ، مع أكبر تأثير لوحظ في مجموعة الجرعات العالية (ص < 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفضت نسبة W / D في الرئة وتلف الأنسجة في المجموعات المعالجة بالشيكونين بشكل ملحوظ بطريقة تعتمد على الجرعة. بالإضافة إلى ذلك ، قلل الشيكونين بشكل كبير من التعبير عن HIF-1α و VEGF و TNF-α و IL-6 ، حيث أظهرت مجموعة الجرعات العالية الانخفاض الأكثر وضوحا (ص < 0.05). يخفف الشيكونين من إصابة الرئة الحادة في الفئران الإنتانية ، وربما عن طريق تثبيط التعبير عن HIF-1α وتقليل إنتاج العوامل الالتهابية ذات الصلة.

الإنتان هو استجابة التهابية جهازية شديدة تسببها العدوى. ¹ غالبا ما يؤدي إلى خلل وظيفي في أعضاء متعددة ويمكن أن يصبح مهددا للحياة مع تقدم الحالة. ² على الرغم من استخدام العلاجات مثل التهوية الميكانيكية والرعاية الداعمة، لا تزال معدلات الوفيات الناجمة عن ALI المرتبط بالإنتان مرتفعة، حيث تصل إلى 30٪ -40٪³. تعالج هذه العلاجات بشكل أساسي الأعراض بدلا من الأسباب الكامنة ، مما يحد من فعاليتها بشكل عام. لذلك ، فإن تحديد الأساليب العلاجية الجديدة التي تستهدف أسباب إصابة الرئة يمكن أن يحسن بشكل كبير نتائج المرضى في الإنتان.

حددت الدراسات الحديثة العامل المحفز لنقص الأكسجة -1α (HIF-1α) كمنظم حاسم في تطور ALI^{الناجم عن الإنتان 4،5}. يتراكم HIF-1α في أنسجة الرئة أثناء الإنتان ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجينات النهائية التي تؤدي إلى تفاقم الالتهاب وتلف الأنسجة⁶. تساهم هذه العملية بشكل كبير في تفاقم إصابة الرئة. لذلك ، فإن استهداف مسار إشارات HIF-1α يوفر نهجا واعدا للتخفيف من الاستجابات الالتهابية ونقص الأكسجين التي تظهر في ALI الناجم عن تعفن الدم.

في البحث عن علاجات أكثر فعالية ، قدم الطب الصيني التقليدي (TCM) رؤى قيمة^7،8. الشيكونين هو مركب أنثراكينون مستخرج من Lithospermum erythrorhizon⁷. يظهر تأثيرات ملحوظة مضادة^{للالتهابات 9} ، ومضادة للبكتيريا¹⁰ ، ومضادة للورم¹¹. يمكن أن يخفف الشيكونين من إصابة الرئة الناجمة عن عديد السكاريد الدهني (LPS) ، مما يشير إلى دوره العلاجي المحتمل في أمراض الرئة¹². في الوقت نفسه ، اقترحت بعض الدراسات أيضا أن الشيكونين قد يخفف من الضرر التأكسدي الناجم عن الإنتان عن طريق تنظيم نظام البلاعم أحادي النواة ، وتحقيق التوازن بين الاستجابات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء التأثيرات الوقائية للشيكونين في ALI الناجم عن الإنتان ليست مفهومة تماما. يمثل هذا فجوة خطيرة في البحث الحالي.

في هذه الدراسة ، نهدف إلى استكشاف التأثيرات الوقائية للشيكونين في نموذج فأر من ALI الناجم عن الإنتان باستخدام ربط الرأس والثقب (CLP). تلعب تقنية CLP دورا مهما في أبحاث الإنتان لأنها يمكن أن تحاكي الاستجابات الالتهابية الجهازية المعقدة والخلل الوظيفي متعدد الأعضاء ، مما يجعلها مناسبة لتقييم فعالية استراتيجيات العلاج الجديدة. تعد تقنية CLP أكثر صلة سريريا نسبيا مقارنة بطرق حقن LPS التقليدية: فهي تحاكي الاستجابة الالتهابية الجهازية الناجمة عن نقل ميكروبات الأمعاء ، وهي أقرب إلى العملية المرضية للتعفن السريري. يمكن تصنيفه والتحكم فيه: من خلال ضبط طول الربط وحجم الثقب ، يمكن التحكم في شدة المرض ، وهو مناسب لدراسة الإنتان بأكملها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنه محاكاة التغيرات الديناميكية المماثلة في الخلل الوظيفي متعدد الأعضاء واستجابة السيتوكين. من خلال التحقيق في دور الشيكونين في تعديل مسار إشارات HIF-1α / VEGF ، نأمل في تقديم رؤى حول الاستراتيجيات العلاجية الجديدة التي تعالج الآليات الأساسية لإصابة الرئة المرتبطة بالإنتان ، مما قد يحسن النتائج السريرية.

حصل البروتوكول على موافقة من مركز التجريبية بجامعة ونتشو الطبية. تم استخدام ذكور C57Bl / 6 فئران (5-6 أشهر ؛ 20-25 جم) في الدراسة الحالية. تفاصيل الكواشف الرئيسية والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير نموذج فأر الإنتان

1. الفئران المنزلية تحت درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية ، ورطوبة 50٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة.
2. بعد فترة تأقلم مدتها 7 أيام ، قسم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: مجموعة الشام ، والمجموعة النموذجية ، ومجموعة العلاج بجرعة منخفضة ، ومجموعة العلاج بالجرعات العالية ، مع 20 فأرا في كل مجموعة.
3. بناء على مراجع من دراسة سابقة¹³ ، عالج مجموعة الجرعات المنخفضة بتركيز 12.5 مجم / كجم من البوربورين لمدة 14 يوما ، ومجموعة الجرعات العالية بتركيز 50 مجم / كجم لمدة 14 يوما. بالنسبة لمجموعة الجراحة الصورية، قم بإجراء بضع البطن، والجر الرأسي، والتصغير، والإغلاق دون ربط أو ثقب، والعلاج بنفس الجرعة من المحلول الملحي الفسيولوجي لمدة 14 يوما. الخطوات التجريبية لمجموعة الإنتان هي كما يلي.
4. بعد الصيام طوال الليل (سمح بالماء) ، قم بتخدير الفئران بالبنتوباربيتال الصوديوم (40-80 مجم / كجم) في ظل ظروف معقمة طوال العملية. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
5. تحقق من التخدير المناسب مثل تباطؤ معدل التنفس ، وانخفاض توتر العضلات ، وعدم وجود استجابة واضحة للإجهاد عند تثبيت الأطراف السفلية برفق باستخدام ملقط مرقئ.
6. إجراء التطهير مع 75 ٪ الإيثانول ، 3x. قم بعمل شق طولي يبلغ حوالي 1 سم في الوضع الأيسر الأوسط لبطن الفأر ، وافتح الجلد واللفافة والعضلات في طبقات لكشف تجويف البطن.
7. باستخدام ملقط العين غير الحاد في كلتا يديك ، استكشف تجويف البطن برفق ، وحدد موقع أعور الفأر وحرره ، وربطه على مسافة حوالي 1 سم من نهاية الأعور.
8. استخدم إبرة 21G لثقب نهاية الأعور وربطها ، واضغط برفق على كمية صغيرة من محتوى الأمعاء من موقع البزل باستخدام ملقط العين غير الحاد ثم استرجعه في الأعور.
9. قم بإجراء إنعاش السوائل تحت الجلد باستخدام 1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪. لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. نلاحظ أن الذي خضع لعملية جراحية لا يتم إعادته إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
10. بعد 7 أيام من نمذجة CLP ، قم بإعطاء التخدير المفرط للقتل الرحيم.
    ملاحظة: نظرا للآثار المهيجة المحتملة للبوربورين على الجلد والجهاز التنفسي والجهاز الهضمي ، فضلا عن سميتها العالية للكائنات المائية ، والتلوث البيئي ، استخدم الحماية الشخصية أثناء التجربة.

2. تقييم النماذج الحيوانية

1. مراقبة بقاء الفأر
   1. قم بالتعامل مع كما هو موضح أعلاه. سجل معدل الوفيات في غضون أسبوع واحد بعد النمذجة للتحليل الإحصائي. تموت بعض الفئران بدون تعفن الدم قبل القتل الرحيم ، بينما تتمتع الفئران النموذجية CLP بمعدل وفيات معين (الجدول 1).
   2. قياس نسبة الوزن الرطب إلى الجاف في الرئة
      1. بعد 24 ساعة من النمذجة ، قم بتخدير الفئران مرة أخرى وفقا للخطوات 1.4-1.5.
      2. قم بعمل شق طولي بطول 1 سم تقريبا على الجانب الأيسر من خط الوسط الترقوة للفأر ، وقم بإزالة طبقات الجلد واللفافة والعضلات لكشف تجويف الصدر بالمقص الجراحي والملقط.
      3. قم بإزالة الرئة اليسرى وتصريف السائل السطحي. قم بقياس الوزن الرطب ثم جففه في فرن 80 درجة مئوية لمدة 72 ساعة إلى وزن ثابت للحصول على الوزن الجاف.
      4. احسب محتوى ماء الرئة على النحو التالي:
         محتوى ماء الرئة = (الوزن الرطب - الوزن الجاف) / الوزن الرطب × 100٪.
   3. مقارنة نسيجية مرضية لأنسجة الرئة
      1. في نقاط زمنية محددة، اجمع الرئة اليسرى كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2. ثبت الرئة في الفورمالديهايد المحايد بنسبة 10٪ ، وقم بتضمينها في البارافين ، وقم بتقسيمها بسمك 5 ميكرومتر.
      2. قم بإزالة الشمع من الرئة في الزيلين ، 2x ، لمدة 5-10 دقائق في كل مرة. قم بإجراء سلسلة من الإماهة بالإيثانول بنسبة 100٪ و 95٪ و 85٪ و 75٪ لمدة 3 دقائق لكل تدرج. نقع في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
      3. قم بتلطيخ ما يقرب من 100 مل من محلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفه بالماء المقطر لإزالة أي لون عائم.
      4. أضف حوالي 70 مل من محلول التمايز وانقعه لمدة 30 ثانية. ثم انقع في ماء الصنبور 2x ، كل مرة لمدة 3-5 دقائق.
      5. أضف ما يقرب من 100 مل من محلول صبغة اليوزين بالتنقيط لمدة دقيقتين. اسكب محلول الصبغة الزائد وقم بتجفيفه بسرعة كما هو موضح أدناه.
      6. قم بإجراء الجفاف والشفافية والختم كما هو موضح أدناه.
         1. انقع العينات في الإيثانول المتدرج: 75٪ و 85٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول (I) لمدة 2-3 ثوان لكل منهما. نقع في 100٪ من الإيثانول (II) لمدة دقيقة واحدة ، وانقع في الزيلين 2x لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. باستخدام ماصة أو قطارة ، قم بتقطير اللثة المحايدة على سطح شرائح الأنسجة ووزعها بالتساوي قدر الإمكان لتجنب تكوين الفقاعات. ختم ومراقبة تحت المجهر عند 400x.
      7. حدد 10 حقول عشوائية لكل قسم من الرئة. اطلب من أخصائي علم الأمراض تسجيل التغيرات المرضية مثل الوذمة السنخية والنزيف وتسلل العدلات من 0 (طبيعي) إلى 4 (ضرر شديد). استخدم النتيجة الإجمالية للتقييم.
   4. النشاف الغربي
      1. استخرج البروتينات النووية من أنسجة الرئة وفقا لتعليمات مجموعة استخراج البروتين النووي ، وقياس تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. قم بإعداد عينات تحميل البروتين مع 50 ميكروغرام من البروتين المحملة لكل عينة. تحضير جل فصل SDS-PAGE (10٪) وجل التكديس (3٪). قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 80 فولت لمدة 45 دقيقة ، ثم انقل البروتين إلى غشاء PVDF عند 110 فولت لمدة 60 دقيقة بعد دخول العينات إلى هلام الفصل.
      3. نقل البروتينات إلى الغشاء وكتلة لمدة 60 دقيقة. احتضان بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد ، 1: 1000) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بحضانة الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد ، 1: 1000) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
      4. اغسل الغشاء باستخدام TBST واستخدم ECL للتصور. في غرفة مظلمة ، أضف الكواشف المحضرة إلى غشاء PVDF وقم بإجراء التصوير الاهتزازي والفلورة. تتفاعل كواشف ECL مع الجزيئات الحيوية الموجودة على الغشاء ، مما ينتج عنه تفاعلات تلألؤ كيميائي قوية ، والتي يتم تسجيلها بواسطة أدوات التصوير الفلوري.
      5. قم بتحليل قيمة التدرج الرمادي لنطاقات البروتين باستخدام نظام تحليل الصور ، وطريقة القياس الكمي للنطاق (للحصول على معلومات مفصلة عن النظام المستخدم لتحليل قياس كثافة النطاق ، انظر صورة المعاهد الوطنية للصحة).
   5. التحليل الإحصائي
      1. استخدم SPSS 26.0 للتحليل الإحصائي. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة وسائل المجموعات المتعددة ، واختبارات LSD-t للمقارنات الزوجية. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

لتقييم الإمكانات العلاجية للشيكونين ، قمنا أولا بتقييم تأثيره على البقاء على قيد الحياة في الفئران الإنتانية على مدى 7 أيام. أدى العلاج بالشيكونين إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1).

نظرا لانتشار إصابة الرئة في الإنتان ، قمنا أيضا بتقييم الوذمة الرئوية في الفئران. تم تقييم الوذمة الرئوية عن طريق قياس نسبة الوزن الرطب إلى الجاف في الرئة (W / D). ارتفعت نسبة W / D بشكل ملحوظ في المجموعة النموذجية مقارنة بالمجموعة الوهمية (p < 0.05). خفف علاج الشيكونين من هذا التأثير بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهرت مجموعة الجرعات العالية انخفاضا أكبر في وذمة الرئة من مجموعة الجرعات المنخفضة (ص < 0.05) (الشكل 2).

لمزيد من التحقق من صحة التأثير الوقائي للشيكونين على أنسجة الرئة ، تم إجراء تحليل نسيجي مرضي. أظهرت المجموعة الوهمية بنية رئوية طبيعية ، وفي الوقت نفسه ، أظهرت مجموعة نموذج CLP تلفا ملحوظا في الأنسجة ، بما في ذلك الوذمة الواسعة والنزيف وتسلل الخلايا الالتهابية. تمشيا مع انخفاض نسبة W / D ، خفف علاج الشيكونين من هذه التغيرات المرضية بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهرت الفئران في مجموعة الجرعات العالية تشوهات نسيجية مرضية أقل بكثير مقارنة بمجموعة نموذج CLP ، وكانت درجاتها المرضية أقل بشكل ملحوظ من تلك الموجودة في مجموعة الجرعة المنخفضة (ص < 0.05 ؛ ص 0.05 ؛ ص ، 0.05 ؛ ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، 0.05 ، ص ، الشكل 3).

نظرا لأن كلا من الالتهاب ونقص الأكسجة هما الدافعان الرئيسيان لإصابة الرئة الناجمة عن الإنتان ، فقد قمنا بعد ذلك بفحص مستويات التعبير عن البروتينات الرئيسية المشاركة في هذه المسارات. كشف تحليل اللطخة الغربية أن مجموعة نموذج CLP لديها مستويات مرتفعة بشكل كبير من TNF-αand و IL-6 و VEGF ، مما يشير إلى استجابة التهابية (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن HIF-1α و VEGF بشكل كبير في مجموعة النماذج ، مما يؤكد زيادة نقص الأكسجة (الشكل 5). قلل علاج الشيكونين بشكل كبير من التعبير عن هذه البروتينات بطريقة تعتمد على الجرعة ، حيث أظهرت مجموعة الجرعات العالية قمعا أكبر ل HIF-1α و VEGF و TNF-α و IL-6 مقارنة بمجموعة الجرعات المنخفضة (ص < 0.05; الشكل 4 والشكل 5). تدعم هذه النتائج الجزيئية الدور الوقائي للشيكونين ، مما يسلط الضوء على قدرته على تعديل كل من نقص الأكسجة والالتهاب في الفئران الإنتانية.

الشكل 1: مقارنة معدلات البقاء على قيد الحياة بين مجموعات مختلفة من الفئران الإنتانية. تم تجميع الفئران وإخضاعها ل CLP جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير ، وتم رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة لتسجيل حالة بقائها على قيد الحياة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثيرات الشيكونين على نسبة W / D في الرئة في الفئران الإنتانية. تم تجميع الفئران وإخضاعها ل CLP جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك تم تسجيل نسبة W / D للرئة. ^{< P}0.05 مقارنة بمجموعة SHOM ، ^BP < 0.05 مقارنة بمجموعة الإنتان ، و ^CP < 0.05 مقارنة بمجموعة العلاج بالجرعة المنخفضة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة القيم المتوسطة لمجموعات متعددة ، وتم استخدام اختبار LSD-t للمقارنة الزوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التغيرات المجهرية في أمراض أنسجة الرئة عبر المجموعات. تم تجميع الفئران وإخضاعها ل CLP مع العلاج بالعقاقير لمدة 24 ساعة. ثم تم حصاد أنسجة الرئة من أجل تلطيخ HE. تعرض اللوحة اليسرى صورا تمثيلية بتكبير 400x (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). يمكن رؤية الوذمة والنزيف وتسلل الخلايا الالتهابية على نطاق واسع في المجموعة النموذجية كما هو موضح في السهم. تقدم اللوحة اليمنى الدرجات النسيجية المرضية المقابلة. بالمقارنة مع مجموعة الزائفة ، كان الفرق كبيرا (ص 0.05). تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة القيم المتوسطة لمجموعات متعددة ، وتم استخدام اختبار LSD-t للمقارنة الزوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مستويات التعبير عن البروتين ل TNF-α و IL-6 في أنسجة الرئة للفئران. تم تجميع الفئران وإخضاعها ل CLP جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك تم الكشف عن التعبير عن البروتينات المشار إليها في أنسجة الرئة. بالمقارنة مع المجموعة الوهمية، زاد التعبير عن عامل نخر الورم α في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (^ز< 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفض التعبير عن TNF-α في مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة بشكل ملحوظ (^hp < 0.05). بالمقارنة مع مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة ، انخفض التعبير عن عامل نخر الورم α في فئة المعالجة بالجرعات العالية ، لكن الفرق لم يكن يعتد به إحصائيا (ⁱp > 0.05). بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع المجموعة الوهمية ، زاد التعبير عن IL-6 في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (^jp < 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفض التعبير عن IL-6 في مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة بشكل ملحوظ (^kp < 0.05). بالمقارنة مع مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة ، انخفض التعبير عن IL-6 في فئة المعالجة بالجرعات العالية ، لكن الفرق لم يكن يعتد به إحصائيا (^lp > 0.05). تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة القيم المتوسطة لمجموعات متعددة ، وتم استخدام اختبار LSD-t للمقارنة الزوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: مستويات التعبير عن البروتين ل HIF-1α و VEGF في أنسجة الرئة للفئران. تم تجميع الفئران وإخضاعها ل CLP جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك تم الكشف عن التعبير عن البروتينات المشار إليها في أنسجة الرئة. بالمقارنة مع مجموعة الوهم، زاد التعبير عن HIF-1α في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (^mp < 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفض التعبير عن HIF-1α في مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة بشكل ملحوظ (ⁿp < 0.05). بالمقارنة مع مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة ، انخفض التعبير عن HIF-1α في مجموعة المعالجة ذات الجرعات العالية ، لكن الفرق لم يكن يعتد به إحصائيا (^ص> 0.05). بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة الوهم ، زاد التعبير عن VEGF في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (^صص < 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفض التعبير عن VEGF في مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة بشكل ملحوظ (^qp < 0.05). بالمقارنة مع مجموعة المعالجة ذات الجرعة المنخفضة، انخفض التعبير عن VEGF في فئة المعالجة بالجرعات العالية، لكن الفرق لم يكن يعتد به إحصائيا (^صص > 0.05). تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة القيم المتوسطة لمجموعات متعددة ، وتم استخدام اختبار LSD-t للمقارنة الزوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معدل بقاء الفئران.

باعتباره النموذج القياسي الذهبي لأبحاث الإنتان ، يعد نموذج CLP خطوة أساسية في هذه التجربة لأن CLP يحاكي تعقيد الإنتان البشري بشكل أفضل من العديد من النماذج الأخرى. لا يزال مرض التهاب الغدة الدعامة الليفوري المرتبط بالإنتان يمثل تحديا سريريا خطيرا بسبب معدلات الوفيات المرتفعة والفعالية المحدودة للعلاجات الحالية^14،15. توضح دراستنا ، لأول مرة ، أن الشيكونين يحسن بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة في الفئران الإنتانية عن طريق تعديل كل من HIF-1α والاستجابات الالتهابية عن طريق إنشاء نموذج CLP.

تعتمد الوفيات الناجمة عن CLP على العديد من المعايير الفنية ، مثل حجم الإبرة ، وطول الأعور المربوطة ، وعدد ثقوب الأعور. إذا كانت الإبرة رفيعة جدا أو لم يكن عدد الإبر كافيا ، فلن تسبب تفاعل تعفن الدم الجهازي. إذا كانت الإبرة سميكة جدا أو كان عدد مرات استخدام الإبرة كثيرا جدا ، فإن الفئران عرضة للموت ولا يمكنها المضي قدما في التجربة التالية. لذلك ، من خلال التعديلات الفنية المتكررة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، توصلنا إلى أننا أجرينا الربط على مسافة حوالي 1 سم من نهاية الأعور. استخدمنا إبرة 21G لثقب نهاية الأعور وربطها ، وضغطنا برفق على كمية صغيرة من محتوى الأمعاء من موقع البزل باستخدام ملقط العين غير الحاد قبل إعادة إدخاله مرة أخرى في الأعور. خلال فترة 6 ساعات بعد الجراحة من CLP ، لاحظ ما إذا كانت الفئران تظهر عليها أعراض تعفن الدم مثل الخمول وبطء الحركة والشعر المنتصب وإفرازات العين والإسهال. تشير الملاحظات إلى فائدة البقاء على قيد الحياة المعتمدة على الجرعة التي لوحظت في مجموعة الجرعة العالية من الشيكونين ، وهو ما يتفق مع الأبحاث السابقة حول الإمكانات العلاجية للطب الصيني التقليدي في إدارة الإنتان¹⁶. من المرجح جدا أن يكون الشيكونين بمثابة عامل مساعد أو بديل قيم للعلاجات الحالية ل ALI الناجم عن الإنتان^5،17.

كما ذكرنا سابقا ، يمكن أن يوفر هذا النموذج منصة محاكاة حقيقية للآلية المرضية للتعفن^{الدموي 18}. لأنه يمكن أن يحاكي السمات الرئيسية للتعفن البشري ، بما في ذلك الالتهابات البكتيرية المتعددة ، والاستجابات المناعية الديناميكية ، والخلل الوظيفي للأعضاء المتعددة ، والمزيد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنموذج CLP تحسين التحقق من صحة طرق العلاج الحالية وتحسينها ، مثل التحقق من فعالية المضادات الحيوية ومعدلات المناعة والعلاجات المساعدة (مثل فيتامين C والهيدروكورتيزون) ، مما يساعد على تحسين توقيت الجرعة والإعطاء. كما أن النموذج له أهمية كبيرة في الكشف عن الأساس البيولوجي للتحديات السريرية الحالية ، وقضايا مقاومة المضادات الحيوية ، وتوحيد البحوث الانتقالية السريرية ، والذكاء الاصطناعي ، وتحليل البيانات الضخمة ، وغيرها من الجوانب.

تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التكنولوجيا الجوانب التالية. أولا ، البحث والتطوير عن أدوية جديدة والتحقق من صحة استراتيجيات العلاج ، مثل دفع تطوير علاجات الهيستون في المستقبل. ثانيا ، التحليل المتعمق للآليات المناعية واستجابات المضيف ، مثل المساعدة في تطوير العلاجات المعدلة للمناعة ، مثل تطبيق مثبطات مسار الإشارات PD-1 / PD-L1¹⁹. ثالثا ، يمكن استخدام تكامل الإشارات المتعددة والذكاء الاصطناعي ، مثل الجمع بين البيانات الناتجة عن نماذج CLP ، لبناء نماذج تنبؤية للتعفن في المستقبل من خلال التعلم الآلي. رابعا ، استكشاف الميكروبيوم ومكافحة العدوى. في المستقبل ، يمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف جدوى استراتيجيات جديدة لمكافحة العدوى مثل زرع الجراثيم البرازية والعلاج بالعاثيات.

على الرغم من أن نموذج CLP هو طريقة راسخة لإحداث الإنتان ، إلا أنه قد لا يكرر بشكل كامل تعقيد الإنتان البشري ، مما يحد من قابلية تعميم النتائج التي توصلنا إليها. يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية أحجام عينات أكبر واستكشاف تأثيرات الشيكونين في نماذج الإنتان المختلفة للتحقق من صحة هذه النتائج. علاوة على ذلك ، فإن الاستكشاف الأعمق للآليات الجزيئية المعنية ، بما في ذلك التفاعلات المحتملة مع مسارات الإشارات الأخرى ، سيكون أمرا بالغ الأهمية لفهم الإمكانات العلاجية الكاملة للشيكونين.

في الختام ، تحدد دراستنا الشيكونين كمرشح واعد لعلاج ALI الناجم عن الإنتان من خلال نموذج فأر CLP. من خلال استهداف كل من مسارات نقص الأكسجين والالتهابات ، فإن الشيكونين لديه القدرة على تحسين النتائج السريرية لمرضى الإنتان. لا يوفر هذا العمل رؤى جديدة حول آليات إصابة الرئة المرتبطة بالإنتان فحسب ، بل يسلط الضوء أيضا على الدور المحتمل للطب الصيني التقليدي في الاستراتيجيات العلاجية الحديثة.

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

تم دعم الدراسة من قبل مشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (Y2020976).