Bu araştırma, epigenomik düzenleyicileri insan hücrelerine tasarlamayı ve sunmayı amaçlamaktadır. Bunu, toksik DNA kırılmaları oluşturmadan hedeflenen gen modülasyonu için kromatin efektörlerini dCas9'a kaynaştırarak yapıyoruz. Zorluklar, epigenom editörlerini hücrelere verimli bir şekilde iletmek ve kesin hedef özgüllüğü sağlamak etrafında döner.
Ek olarak, kararlı veya geçici gen baskılaması elde etmek hala zordur. Bu protokol, herhangi bir parçalanma mekanizmasını önleyerek toksisiteyi ve genomik kararsızlığı azaltır. Kalıcı DNA dizisi değişiklikleri olmadan kontrollü gen ekspresyon modülasyonu için iki dağıtım yöntemini tanımlar.
Bu yöntemler, dCas9'a farklı füzyonları test etmek ve temel kromatin biyolojisini incelemek için uygulanabilir. Mevcut epigenom editörleri, genom çapında ekranlar için kullanılabilir ve terapötik uygulamalar için potansiyele sahiptir. Başlamak için, K-562 hücrelerini% 10 FBS ve penisilin streptomisin glutamin ile desteklenmiş RPMI ortamı ile bir şişede tutun.
Nükleofeksiyon gününde, CRISPRoff mRNA'yı steril bir RNAse içermeyen mikrosantrifüj tüpünde çözün ve tüpü nazikçe girdap haline getirin. Buz üzerine yerleştirilmiş bir PCR şerit tüpünün her bir oyuğunda beş hücrenin gücüne 2.0 kez 10 kere iki mikrogram mRNA kullanın. Nükleofeksiyon solüsyonunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve nükleofeksiyondan önce 15 dakika oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
Tripan mavisi canlı/ölü boyama ile otomatik bir hücre sayacı kullanarak K-562 hücrelerini hasat edin ve sayın. Bir şerit küvette nükleofeksiyon için, steril bir mikrosantrifüj tüpüne numune başına yaklaşık iki kez 10 ila beş hücrenin gücünde alikot. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın. Hücre peletine oda sıcaklığında PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
Hücreleri uygun miktarda nükleofektör çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hesaplanan hücre çözeltisi hacmini iki mikrogram CRISPRoff çözeltisine ekleyin. Hücreyi ve mRNA çözeltisini bir küvete aktarın ve kabarcıkların oluşmamasını sağlayın, çünkü bu nükleofeksiyon verimliliğini tehlikeye atabilir.
Alttaki hücreleri yerleştirmek için Nucleocuvette'e hafifçe vurun. Daha sonra, uygun darbe koduna sahip 4D-Nükleofektör sistemini kullanarak hücreleri nükleofect edin. Nabız kodunun farklı hücre tipleri için optimize edilmesi gerekebilir.
Ek optimizasyon gerekiyorsa üreticiye danışın. Nükleofeksiyondan sonra, Nucleocuvette'in kullanılan her bir kuyucuğuna 80 mikrolitre RPMI ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu, 400 mikrolitre önceden ısıtılmış RPMI ortamı içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın.
Tüm akış sitometri standardını veya FSC dosyalarını yeni bir çalışma sayfasına sürükleyip bırakarak FlowJo'ya yükleyin. Kapı yapmaya başlamak için tüm örneklere tıklayın. İlgili dosyaya çift tıklayarak bir kontrol örneği açın.
Çokgen aracını kullanarak FSC-A'ya karşı SSC-A grafiğinde canlı hücreler için bir geçit oluşturun. Artık tüm örneklerin listesinde örnek adının altında bir canlı hücreler sekmesi görünmelidir. Bu kapıya sağ tıklayın ve bu geçidi tüm örneklere uygulamak için analizi gruba kopyala'yı seçin.
Yalnızca canlı hücreleri seçmek için canlı hücreler kapısına çift tıklayın. Eksenleri FSC-A'ya karşı FSC-H olarak değiştirin. Yalnızca tek hücreler için geçit vermek üzere bir çokgen çizin.
Kılavuz ifade eden hücrelerin kapısını kapatmak için, yalnızca tek hücreleri seçmek için tek hücre kapısına çift tıklayın. Eksenleri PE-CF594-A yerine FSC-A olarak değiştirin. Çokgen aracını kullanarak kılavuz ifade eden hücreler için bir kapı çizin.
Son kurulum kapısına çift tıklayın, tek hücreler veya kılavuz ifade eden hücreler. Epigenom editörünün mavi bir floresan proteini veya BFP füzyonunu kodladığı bir plazmit transfeksiyonu gerçekleştiriyorsanız, ikinci gün numuneleri için BFP pozitif hücreler için bir kapı oluşturun. GFP negatif hücreleri tanımlamak ve geçit oluşturmak için FSC-A'ya karşı BB515-A'yı çizerek muhabir ifadesi için bir kapı oluşturun.
Ardından, bu geçidi tüm örneklere uygulayın. Yolluk kurulumunu tamamladıktan sonra üst panelde bulunan tablo düzenleyiciye tıklayın. BFP pozitif ve GFP negatif hücreler gibi popülasyonları analiz için sürükleyin.
Tablo düzenleyici panelinde, tablo oluştur'u tıklayın ve normalleştirme hesaplamaları için bir elektronik tabloya yapıştırmadan önce verileri kopyalayın. Şimdi, kontrol örneğindeki GFP negatif gibi raportör negatif hücrelerin sayısını diğer tüm örneklerden çıkarın. Bu, muhabirin arka planda susturulmasını düzeltir.
Bir transfeksiyon gerçekleştiriyorsanız, tüm değerleri BFP pozitif hücrelerin yüzdesine normalleştirmek için her değeri ikinci günde ölçülen BFP pozitif hücrelerin yüzdesine bölün, ardından 100 ile çarpın. Bu, düzenlenen hücrelerin transfeksiyon verimliliği normalleştirilmiş değerini verir. Epigenom düzenleme süresi boyunca değişiklikleri temsil eden çizgi grafikler oluşturmak için verileri çizin.
Tüm epigenom düzenleme deneyleri için, hedef lokuslardaki değişikliklerin epigenom düzenleyicisinin aşırı ekspresyonu veya spesifik olmayan bağlanmasından ziyade epigenom düzenlemesinden kaynaklandığını doğrulamak için hedeflemeyen bir kılavuz kontrolü önerilir. Epigenom editörünün dağıtım yöntemini dikkate almak önemlidir. Deneysel bağlam göz önüne alındığında plazmid DNA transfeksiyonu veya mRNA nükleofeksiyonu tercih edilebilir.
Hücre tipinin, deneysel zaman çizelgesinin, teslimat okumasının ve teslimat etkinliğinin dikkate alınması, tercih edilen dağıtım yöntemini etkileyebilir. Transfeksiyondan iki gün sonra yüksek BFP seviyeleri eksprese eden hücreler, epigenom editörü ile başarılı transfeksiyonu gösterir. Hem CRISPRoff hem de CRISPRi, transfeksiyondan sonraki beşinci günde genin en yüksek susturulmasını gösterir.
mRNA nükleofeksiyon deneylerinde, CRISPRoff ile nükleofeksiyondan sonraki üçüncü günde güçlü gen susturma gözlenir.
