NanoDispenser tabanlı transfeksiyon protokolü bu videoda açıklamak için geliştirilen ilk kullanıcı dostu, yüksek iş lenme transfeksiyon yöntemi alanında bile yeni başlayanlar başarılı olmasını sağlar temsil eder. Bu yüksek iş yapma tekniği kolaydır 384 bağımsız durum ile hücre transfeksiyon sağlar. Şu andan itibaren, yöntem gerekli reaktif nano hacmi nedeniyle düşük maliyetlidir.
Tüm hücre tipi için en iyi transfeksiyon parametrelerini tanımlamak için, kaynak DNA konsantrasyonu sabit tutmak öneririz, ve transfected DNA değişen miktarlarda kullanarak, transfeksiyon reagent, ve hücre sayısı. 40 mikrolitrelik hücre süspansiyonunu dağıtmak için peristaltik sıvı işleyici cihazına 10 mikrolitrelik bir kaset monte edin ve uygun bir program hazırlayın. İlk olarak, akış hızı parametresini düşük hızda hücreleri dağıtmak için ayarlayın ve kuyuların alt kısmında ki aşırı stres ve yüksek etki yle hücrelere olası zararı teşvik edin.
Daha sonra, dağıtım yüksekliğini 11,43 milimetreye ayarlayın. Yükseklik dağıtım işlemi sırasında kuyuların altındaki hücre etkisini azaltmak için yeterince yüksek olmalıdır, ancak dağıtım başında damlacıkların tutulmasını önlemek için yeterince düşük. Daha sonra, her satırı dağıttıktan sonra dağıtım kafasının plaka üzerinde serbest çeşnisi olmasını sağlamak için plaka net liğini 16 milimetreye ayarlayın.
Peristaltik sıvı işleyici kafa yüksekliğinin uygun ayarlarını görsel olarak kontrol edin. Dağıtım sırasında dağıtım uçlarında damla tutulmadığından emin olun. Ayrıca, başın her satırı dağıttıktan sonra başın yer değiştirmesine izin verecek kadar yüksek olduğunu da doğrulayın.
ADE dağıtımını sağlamak için picklists oluşturmak için, DNA miktarlarını yönetmek ve 384 kuyu plaka biçiminde dört plazmidi karıştırmak için kullanıcı dostu bir elektronik tablo makrosu geliştirilmiştir. En iyi birimler elektronik tablonun bazı hücrelerinde önceden doldurulur, ancak değiştirilebilir. Pembe alanlarda transfeksiyon reaktifi veya TR karışım değeri 500 nanolitre olarak ayarlanır.
Kaynak plaka kuyularında minimum hacim değeri dört mikrolitreye, kaynak plakadaki maksimum hacim ise 11,25 mikrolitreye ayarlanır. Altta yatan DNA'ya karşılık gelen mavi alanlarda mikrolitre DNA'sı başına 100 nanogram girin. Daha sonra, plakanın 384 kuyuya karşılık gelen gri ve yeşil alanlara istenilen DNA miktarını girin.
Miktarları ve plazmid adlarını girin ve aynı plazmidin birkaç kuyuda transfekteritedilmesi gerekiyorsa aynı yazımın kullanıldığından emin olun. Girilen değerleri doğrulamak için picklists oluştur'a tıklayın ve istenirse, NanoDispenser tarafından işlenemeyen hataları veya birimleri belirten turuncu dolu hücreleri düzeltin. Hiçbiri algılanmazsa, makro 384 iyi dağıtım kılavuzu, DNA toplama listesi dosyası ve ilgili sayfalarda toplanan verilerden TR toplama listesi dosyası oluşturur.
Dağıtımdan önce doldurulacak kuyuları görselleştirmek için şablonu kaynak plaka sayfasından yazdırın. Plazmid adları ve minimum dolgu hacimleri belirtilir. Aşağıdaki kuyularda doldurulacak transfeksiyon reaktif karışım hacimleri TR olarak gösterilir ve yeşil renkte vurgulanır.
DNA kaynak plakasını hazırlamak için, distile su kullanarak mikrolitre başına 100 nanograma kadar depolanan DNA plazmidini seyreltin. Şimdi, 384 kuyu ızgarasını plaka boyutlarına göre ayarla. Tablette 384 Kuyu Pipetleme Kılavuzu Uygulamasını açın.
Kaynak yeri alt ekrana ızgaraya yerleştirin. Sol üst kalibrasyon menüsünde, yeşil kuyuları plakanın dört köşekuyularına ayarlamak için ızgara ve kuyuların boyutunu geliştirmek veya azaltmak için artı veya eksi'yi tıklatın. Çift taraflı bant kullanarak, dağıtım sırasında kaynak plaka hareketlerini önlemek için ekrana 3D baskılı plaka adaptörü monte edin.
Gerekirse, kılavuz okları ve yukarı, aşağı, sağ, sol düğmeleri kullanarak kalibre ızgarayı plaka konumuna ayarlamak için hareket ettirin. Izgara ve kuyu boyutları düzgün kalibre edildikten ve bulunduğunda, kilit kalibrasyon kutusunu işaretleyin. Dosyaya tıklayın ve 384-Wells-Pipetting-Guide'ı açın.
csv dosyası. Belirtilen konsantrasyonda belirtilen plazmid hacmini, beklenen plakanın uygun hedef hedefine karşılık gelen beyaz vurgulu kuyuya manuel olarak dağıtmak için ekran yönergelerini izleyin. DNA dağıtım işleminde geri veya daha ileri gitmek için eksi veya artı oklar kullanın.
Yüklemek için ilk transfeksiyon reaktif çözeltisi ulaştıktan sonra dağıtım durdurun. DNA dağıtımı tamamlandıktan sonra, kaynak plakayı bağdaştırıcıdan çıkarın. Birkaç kaynak plakası doldurulacaksa, bağdaştırıcıya yeni bir kaynak plakası yerleştirin ve dağıtım yönergelerini uygulayın.
Uygun sıvı tesviyesini sağlamak ve ADE baz transferlerinde hataya yol açan kabarcıkları temizlemek için DNA dolu kaynak plakaları santrifüj edin. Şimdi, el ile dağıtılan hacimleri kontrol etmek için bir anket çalıştırın. NanoDispenser PC'de NanoDispenser programını çalıştırın.
Tanı sekmesine gidin, kaynak plaka çıkış kutusunu işaretleyin, kaynak plakayı plaka tutucuya yükleyin ve plakaya girmek için işaretleyin. İstendiğinde, NanoDispenser'ı sulu arabellek dağıtım moduna ayarlamak için 384LDV_AQ_B2 seçin ve Tamam tuşuna basın. Çeşitli menüde anket seçin. Ve başlatmak için tıklayın.
Analiz etmek için önceden doldurulmuş kuyuları seçin ve git düğmesine tıklayın. Ölçülen birimlerin beklenenlerle eşleşip, 12 mikrolitreden fazla hacimle kuyu yüklenmediğinden emin olun. 10 mililitre önceden ısıtılmış serumsuz ortam la yeni bir steril kap doldurarak ve tüp organizatörü ne batmış serum suz orta ile tüp prime.
Peristaltik sıvı işleyicisinin ana düğmesine yaklaşık 10 saniye basın. Dağıtım başlığından gelen akışı görsel olarak inceleyerek ucun tıkanmamış olduğundan emin olun. Peristaltik sıvı işleyici plaka taşıyıcıüzerine steril 384 kuyu kültür plakası yerleştirin ve kapağını çıkarın.
384 kuyu plakasının her bir kuyununda bir mikrolitre dağıtmak için önceden kalibre edilmiş programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık sekiz saniyedir. Sonra 384 iyi plaka kapağını değiştirin.
ADE güdümlü DNA dağıtımını kurmak için seçici yazılımı çalıştırın. 384LDV kaynaklı 384 kuyu ayarlayın. 384LDV_AQ_B2 seçerek aygıtı sulu arabellek dağıtım moduna ayarlayın.
Ve hedef plaka türleri Greiner_384PS_781096. Onay işaretini yok etmek için en iyi leştirilmiş aktarım iş bakışını. Liste seç sekmesini seçin.
Alma'ya tıklayın. Ve DNA_Picklist_CSV dosyasını seçin. Sonra, play tıklayın ve protokolü kaydedin.
Seçim listesinin beklenen deneysel tasarımla eşleştiğinden emin olmak için program dağıtımlarının simülasyonunu gerçekleştirmek için benzetme'ye tıklayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve dağıtım programını başlatın. Sorulduğunda, istenen kaynak plakayı takın.
Ve sonra NanoDispenser'daki hedef plaka. Transfeksiyon reaktif idamasını ayarlamak için, serumsuz ortamdalipopoplyplex transfeksiyon reaktifini 1 x son konsantrasyona ve tüpü girdap haline getirmek için bir biyogüvenlik kabininde çalışın. TR karışımını, makro tarafından önceden tanımlanmış kaynak plakasına göre ve önceden kalibre edilmiş 384 kuyu borulama kılavuzu uygulamasını kullanarak hemen dağıtın.
TR dağıtımını takiben, yüklü DNA için daha önce yapıldığı gibi TR yüklü hacimleri kontrol etmek için bir anket yapın. Analiz etmek için transfeksiyon reaksiyonu karışımı önceden doldurulmuş kuyuları seçin. Ve git düğmesine tıklayın.
Ölçülen birimlerin beklenen hacimle eşleşin. Ve hiçbir kuyunun 12 mikrolitreden fazla hacimle yüklenmediğinden emin olun. Şimdi seçim listesi yazılımında DNA toplama listesinin sıfırını gerçekleştirin.
Aygıt parametrelerinin hala sulu arabelleklere ayarlı olduğundan doğrulayın. Doğru kaynak ve hedef plaka türlerini girin. Seçim listesi sekmesinde, örnek listeyi temizlemek için sıfırla'yı tıklatın.
Sonra içe aktarma tıklayın ve TR_Picklist seçin. CSV dosyası. Oyuna tıklayın.
İstenirse protokolü kaydedin ve simüle düğmesine tıklayarak uygun tasarımı sağlamak için program transfection reagent karışım dağıtımlarının bir simülasyonunu gerçekleştirin. Daha önce olduğu gibi, çalıştır düğmesine tıklayıp dağıtım programına başladıktan sonra kaynak plakayı ve varış plakasını istediğiniz gibi NanoDipsenser'e yerleştirin. Hücreleri dağıtmak için, hazırlanan hücre süspansiyon ile yeni bir steril damar doldurun ve yanlışlıklar ve hücre yoğunluğuna yol açan sedimantasyon önlemek için karıştırın.
Tüp düzenleyiciyi çözeltiye takın. Ardından, hücre süspansiyonu dağıtım başlığından sifonu çekmeye başlayana kadar asal düğmeye basın. Yıkama sırasında dağıtım kafasının akışını görsel olarak inceleyerek ucun tıkanmamış olduğundan emin olun ve her tüpün hücre süspansiyonuyla yüklendiğinden emin olun.
Şimdi, PERistaltic sıvı işleyici plaka taşıyıcı üzerinde DNA ve TR dolu 384 iyi hedef plaka yükleyin ve kapağını çıkarın. Tam 384 kuyu plaka üzerinde hücre süspansiyon 40 mikrolitre dağıtmak için önceden kalibre programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık 45 saniyedir.
Son olarak, 384 kuyu plakakapağını değiştirin. Lipopoplyplex reaktif kullanarak HeLa hücrelerinin transfeksiyonu başarılı oldu. Beş ila 30 nanogram arasında değişen DNA miktarları aynı verimi ve bir mikrolitre dilüent hacminde %90'a kadar hücre transfeksiyonu gösterdi.
Buna karşılık, daha yüksek miktarlarda transfected hücrelerin yüzdesinde ani bir azalmaya neden oldu. 15 nanolitreile dört mikrolitre arasında değişen çeşitli dilüent hacimleri test edildi ve bir mikrolitre en iyi koşul olarak tanımlandı. Bu protokolün verimini daha da artırmak için iki verimli DNA depolama yöntemi test edildi yani plaka veya dondurulmuş depolama kuru depolama.
Her iki depolama yöntemi de yedi güne kadar saklanan yeni dağıtılan DNA çözeltisinden önemli ölçüde farklı sonuçlara yol açmadı. Plazma transfeksiyonu genellikle en az iki farklı plazmid kullandığından, bu protokolün DNA çoklama yeteneği en iyi tanımlanmış koşullar kullanılarak incelendi. Daha önce kullanılan tdTomato kırmızı floresan protein plazmid ifade mVenus parlak sarı floresan protein ifade etmek için modifiye edildi ve her ikisi de daha sonra kotransfection girişimleri nde kullanılmıştır.
Kırmızı veya yeşil floresan pozitif hücre analizi transfeksiyon veriminin yaklaşık %80 olduğunu göstermiştir Ancak kırmızı hücrelerin yaklaşık %100'ü temsili yazılım tabanlı görüntü analizinde görülebileceği gibi plazmidifade eden mVenus ile birlikte transtransekted edilmiştir. Kaynak plakaya DNA dağıtıldıktan sonra. Beklenen birimlerin yüklendiğinden ve 12 mikrolitreyi geçmediğinden emin olmak için bir anket yapın.
Kaynak plakada transfeksiyon reaktifi dağıtırken, santrifüj alt plakaları transfeksiyon etkinliği tam bir kaybına neden olacak gibi kabarcıklar önlemek için deneyin. Bu yöntem biyolojik deney, suçlar ve transfection uygulanabilir ve çoğunlukla 384 iyi plaka formatında yapılabilir için uygundur. Tam geçirmez transfeksiyon, şu anda kötü stratejilerde sıralanamayan aralıklı etkilerin izlenmesini sağlayan daha net döküm tarama dışı yaklaşımlarla bilinen plazmid bazlı yeni uygulamaların önünü açmaktadır.
