Hücre dışı veziküllerin durum hücresi kültürü ortamı gibi sıvılardan ayrılması, araştırmacıların vestiküler kargoyu karakterize etmelerine ve hücre içi iletişim mekanizmalarını keşfetmelerine izin verebilir. Bu teknik, EV'lerin ve hücre dışı proteinlerin, basit ve kullanıcı dostu olan şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterli şekilde ayrılmasını sağlar. PBS'yi 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirmeye başlamak için.
Kontrol ve tunikasin ile muamele edilmiş hücre kültürü şişelerini 10 x ve 100 x objektif lensle bileşik bir mikroskop altında gözlemleyin. Şişeler arasındaki farkları not alın. Ortamı şişeden çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Daha sonra tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin ve süper natantı yeni bir tüpe aktarın. Tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın. Süper natantı yeni bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
Dört adet 15 mililitre üç kilodalton kesme ultra filtrasyon ünitesi alın ve her tüpe beş mililitre PBS ekleyin. Üniteleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj ederek filtreleri astarlayın. PBS'yi ünitelerden çıkardıktan sonra, süpernatantı kontrol ve işlem görmüş koşullardan, her birinde yaklaşık 12,5 mililitre ortam bulunan iki ultra filtreleme ünitesine bölün.
Tüpleri 4.000 G'de bir saat 45 dakika boyunca dört santigrat derecede veya her birimdeki konsantre ortam veya retentat 250 mikrolitre veya daha azına konsantre olana kadar santrifüj yapın. Retentatı her iki kontrol ünitesinden etiketli 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ve işlenmiş ünitelerden başka bir tüpe aktarın. Her mikro santrifüj tüpündeki retentatın toplam hacmini ölçün.
Hacim 500 mikrolitreden azsa, son hacim 500 mikrolitre olana kadar 0.22 mikron filtrelenmiş PBS ekleyin. Tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin. Otomatik kesir toplayıcıyı veya AFC'yi açın.
Kolonu dört santigrat dereceden çıkarın ve sütunun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Retentat numunelerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin, beklerken, AFC atlıkarınca içinde kapakları içe dönük sekiz adet etiketli 1,5 mililitrelik tüp yerleştirin. Barkodu okuyucuya bakacak şekilde sütunu AFC'ye yerleştirin ve ayarları her biri 500 mikrolitrelik sekiz fraksiyon toplayacak ve arabellek hacmini varsayılan olarak ayarlayın.
Ardından, koleksiyonu başlatmak için ekrandaki talimatları doğrulayın. Depolama tamponu sütun matrisinin üst kısmına tamamen emildikten sonra. Kolona 15 mililitre PBS ekleyerek sütunu yıkamaya başlayın.
PBS'yi çok erken eklemeyin, çünkü depolama arabelleğini seyreltir ve yeterli yıkamayı önler. 15 mililitre PBS'nin tamamı matris tarafından emilmeden hemen önce, yıkamayı durdurmak ve sütun matrisinin üstünden kalan PBS'yi mikro pipetle çıkarmak için Tamam'ı tıklayın. Matrise dokunmayın.
Kolonun ortasına 500 mikrolitre numune ekleyin ve çalıştırmaya başlamak için Tamam'ı tıklayın. Numune matrise tamamen emildikten sonra derhal kolona sekiz mililitre PBS ekleyin. AFC, her biri 500 mikrolitrelik sekiz fraksiyonun tümünü toplamadan önce boşluk hacmini otomatik olarak atlıkarınca merkezine atar.
Koşudan sonra, atlıkarınca kesirlerini çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Ardından boş hacmi döngünün ortasından çıkarın. Ardından, kolondan kalan herhangi bir numuneyi yıkamak için kolona 10 mililitre PBS ekleyin.
Ve tövbe edilen numune tamamen yıkandıktan sonra, sütuna 15 mililitre PBS ekleyin. Son PBS matris tarafından emilirken, kolonun matrisinin merkezine 500 mikrolitre 0.5 molar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra sodyum hidroksit emildiğinde, kolona 30 mililitre PBS ekleyin ve akmasına izin verin.
Tüm numunelerle yapıldıktan sonra, kolona 15 mililitre% 0.05 sodyum azid ekleyerek daha sonra kullanmak üzere sütunu koruyun. Kolon matrisinin üstüne yaklaşık beş mililitre sodyum azid bırakın. Sütunu AFC'den çıkarın ve saklamak üzere sütunu dört santigrat dereceye yerleştirmeden önce üst ve alt kapakları takın.
Ultra filtrasyon ünitesini oluşturun. Numune başına iki mililitre, üç kilodalton kesme ultra filtrasyon ünitesi elde edin. Her ünite üç parçadan oluşur, koni, filtre ve silindirden akış.
Her parçayı doğru şekilde etiketleyin. Filtre kısmına bir mililitre PBS ekleyin ve koni parçasıyla kapatın. Ultrafiltrasyon ünitesi koni tarafını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.500 G'de santrifüj edin ve filtrelenmiş PBS'yi silindir içinden akıştan çıkarın.
Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin ve kalan PBS'yi çıkarmak için dört santigrat derecede 1000 G'de iki dakika boyunca santrifüj yapın. Her fraksiyonun dört 500 mikrolitresini birleştirin ve bunları ultrafiltrasyon ünitesine ekleyin. Daha sonra santrifüj sütunları bir saat, 45 dakika boyunca 3, 500 G'de dört santigrat derecede veya retentat seviyesi 100 mikrolitrede olana kadar çakışıyor.
Akış silindirini çıkarın ve içinden akışı atın. Ultra filtreleme ünitesini baş aşağı çevirin ve dört santigrat derecede 1000 XG'de iki dakika boyunca santrifüj yapın. Konideki retentatı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirmeden önce numune hacmini 0.22 mikron filtrelenmiş PBS ile 150 mikrolitreye yapın.
Bireysel fraksiyonların temsili bir batı bloğu CD9, CD63 ve CD81'in güçlü ekspresyonunu gösterdi. Çok az veya hiç ifade içermeyen bir ila dört ihlal beş ila sekiz arasında ihlal eder. Herhangi bir fraksiyonda GM130 veya kalneksin ekspresyonu gözlenmedi.
Albümin sadece altı ila sekiz fraksiyonda mevcuttu. EV ve protein fraksiyonlarının konsantre edilmesinin etkinliği de değerlendirildi. Hücre lizatlarında CD9 ve CD63 ekspresyonu gözlendi.
Her üç CD proteini de kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş örneklerin EV fraksiyonlarında mevcuttu, ancak protein fraksiyonlarında mevcut değildi. Tümör duyarlılık geni 101, hücre lizatlarında mevcuttu, ancak EV veya protein fraksiyonlarında mevcut değildi. GM130 ve kalneksin sadece hücre lizatlarında gözlendi.
Eksozom tükenmiş hücre kültürü ortamının batı lekesinde, EV belirteçleri hücre lizatlarında mevcuttu, ancak medya örneklerinde mevcut değildi. Albümin ekspresyonu protein fraksiyonlarında ve minimal ekspresyon hücre lizatlarında gözlendi. TEM gözlemleri, kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerin EV fraksiyonlarında küresel yapılar göstermiştir.
Bu yapılar her iki örnek tipi protein fraksiyonunda da gözlenmedi. Nanopartikül izleme analizi, kontrol partikül konsantrasyonlarındaki farklılıkları ortaya koymaktadır ve EV fraksiyonlarında işlem görmüş fraksiyonlar, kontrole kıyasla, tunikamisin tedavisinde biraz daha fazla parçacık mevcuttu. Bununla birlikte, protein fraksiyonlarında, EV'lere göre daha az parçacık tespit edildi.
Kontrol ve tedavi koşulları için aynı numune hacmine sahip olmak önemlidir, bu da EV'lerin farklı tedavilerden kolayca karşılaştırılmasını sağlar. EV'leri durum hücresi kültürü ortamından ayırdıktan sonra, veziküllerin protein, RNA ve lipit içeriğini proteomik RNA dizilimi ve lipidomik ile karakterize edebiliriz.
