A separação de vesículas extracelulares de fluidos como meios de cultura de células de condição pode permitir que os pesquisadores caracterizem a carga vesticular e explorem seus mecanismos de comunicação intracelular. Esta técnica permite uma separação suficiente de EVs e proteínas extracelulares de meios de cultura de células condicionadas que é simples e fácil de usar. Para começar, coloque o PBS em um banho de água de 37 graus Celsius.
Observe os frascos de cultura celular tratados com tunicamicina sob um microscópio composto com lente objetiva de 10 x e 100 x. Tome nota das eventuais diferenças entre os frascos. Retire o meio do balão e coloque-o num tubo de 50 mililitros.
Em seguida, centrifugar o tubo a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e transferir o super nadante para um novo tubo. Centrifugar o tubo a 2000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o super natante para um novo tubo e coloque o tubo no gelo.
Pegue quatro unidades de ultrafiltração de corte de 15 mililitros e três quilodaltons e adicione cinco mililitros de PBS a cada tubo. Prepare os filtros centrifugando as unidades a 4.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o PBS das unidades, divida o sobrenadante das condições de controle e tratamento em duas unidades de ultrafiltração, cada uma com aproximadamente 12,5 mililitros de meio em cada.
Centrifugar os tubos a 4 000 g durante uma hora e 45 minutos a quatro graus Celsius ou até que o meio concentrado ou a retenção em cada unidade esteja concentrado a 250 microlitros ou menos. Transfira o retentado de ambas as unidades de controle para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado e das unidades tratadas para outro tubo. Meça o volume total do retentado em cada micro tubo de centrífuga.
Se o volume for inferior a 500 microlitros, adicione 0,22 mícron filtrado PBS até que o volume final seja de 500 microlitros. Coloque os tubos em um congelador de menos 80 graus Celsius. Ligue o coletor automático de frações ou AFC.
Remova a coluna de quatro graus Celsius e permita que a coluna aqueça até a temperatura ambiente. Remova as amostras de retentado do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque-as no gelo para descongelar, enquanto espera, coloque oito tubos rotulados de 1,5 mililitro no carrossel AFC com tampas voltadas para dentro. Insira a coluna no AFC com o código de barras voltado para o leitor e ajuste as configurações para coletar oito frações de 500 microlitros cada e buffer de volume para o padrão.
Em seguida, verifique as instruções na tela para iniciar a coleção. Depois que o buffer de armazenamento é completamente absorvido pela parte superior da matriz da coluna. Comece a lavar a coluna adicionando 15 mililitros de PBS à coluna.
Não adicione PBS muito cedo, pois ele diluirá o buffer de armazenamento e evitará a lavagem adequada. Pouco antes de todos os 15 mililitros de PBS serem absorvidos pela matriz, clique em OK para parar a descarga e remover qualquer PBS residual do topo da matriz da coluna com uma micropipeta. Não toque na matriz.
Adicione 500 microlitros de amostra ao centro da coluna e clique em OK para iniciar a execução. Depois que a amostra for totalmente absorvida pela matriz, adicione imediatamente oito mililitros de PBS à coluna. O AFC dissipa automaticamente o volume vazio para o centro do carrossel antes de coletar todas as oito frações de 500 microlitros cada.
Após a corrida, retire as frações do carrossel e coloque-as no gelo. Em seguida, remova o volume vazio do centro do carrossel. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS à coluna para lavar qualquer amostra residual da coluna.
E uma vez que a amostra arrependida tenha sido totalmente lavada, adicione 15 mililitros de PBS à coluna. Como o PBS final está sendo absorvido pela matriz, adicione 500 microlitros de hidróxido de sódio 0,5 molar ao centro da matriz da coluna. Em seguida, à medida que o hidróxido de sódio é absorvido, adicione 30 mililitros de PBS à coluna e deixe-o lavar.
Uma vez feito com todas as amostras, preserve a coluna para uso posterior, adicionando 15 mililitros de azida de sódio a 0,05% à coluna. Deixe aproximadamente cinco mililitros de azida de sódio no topo da matriz da coluna. Remova a coluna do AFC e prenda as tampas superior e inferior antes de colocar a coluna a quatro graus Celsius para armazenamento.
Construa a unidade de ultrafiltração. Obter dois mililitros, três unidades de ultrafiltração de corte de quilodalton por amostra. Cada unidade é composta por três partes, cone, filtro e fluxo através do cilindro.
Rotule cada peça corretamente. Adicione um mililitro de PBS à porção do filtro e tampe com a peça do cone. Centrifugar o cone da unidade de ultrafiltração de lado para cima a 3.500 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e remover o PBS filtrado do fluxo através do cilindro.
Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo e centrifugar por dois minutos a 1000 G a quatro graus Celsius para remover qualquer PBS restante. Combine quatro 500 microlitros de cada fração e adicione-os à unidade de ultrafiltração. Em seguida, as colunas de centrífuga coincidem por uma hora, 45 minutos a 3.500 G a quatro graus Celsius ou até que o nível de retentado esteja em 100 microlitros.
Remova o fluxo através do cilindro e descarte o fluxo através de. Vire a unidade de ultrafiltração de cabeça para baixo e centrifugar por dois minutos a 1000 XG a quatro graus Celsius. Transfira o retentado no cone para um tubo de 1,5 mililitro e faça o volume da amostra para 150 microlitros com PBS filtrado de 0,22 mícron antes de colocar os tubos em menos 80 graus Celsius congelador.
Um bloco ocidental representativo de frações individuais mostrou forte expressão de CD9, CD63 e CD81. Infrações de um a quatro com pouca ou nenhuma expressão infrações de cinco a oito. Nenhuma expressão de GM130 ou calexina foi observada em nenhuma fração.
A albumina só estava presente nas frações seis a oito. A eficácia da concentração das frações EV e proteica também foi avaliada. A expressão de CD9 e CD63 foi observada nos lisatos celulares.
Todas as três proteínas CD estavam presentes nas frações EV das amostras de controle e tratadas com tunicamicina, mas não nas frações proteicas. O gene de suscetibilidade tumoral 101 estava presente em lisatos celulares, mas não em frações EV ou proteicas. O GM130 e a calexina foram observados apenas nos lisatos celulares.
No western blot de meios de cultura celular esgotados por exossomos, os marcadores EV estavam presentes nos lisados celulares, mas não nas amostras de meios. A expressão de albumina foi observada nas frações proteicas e a expressão mínima nos lisados celulares. As observações do MET demonstraram estruturas esféricas nas frações EV das amostras tratadas com tunicamicina.
Essas estruturas não foram observadas em nenhuma das frações proteicas do tipo amostral. A análise de rastreamento de nanopartículas revela diferenças nas concentrações de partículas de controle e frações tratadas em frações EV em comparação com o controle, um pouco mais de partículas estavam presentes no tratamento com tunicamicina. No entanto, nas frações proteicas, menos partículas foram detectadas em relação aos EVs.
É importante ter o mesmo volume de amostra para as condições de controle e tratadas, permitindo uma fácil comparação de EVs dos diferentes tratamentos. Após a separação dos EVs do meio de cultura celular da condição, podemos caracterizar o conteúdo de proteínas, RNA e lipídios das vesículas com sequenciamento de RNA proteômico e lipidômica.
