La separazione delle vescicole extracellulari da fluidi come i terreni di coltura cellulare può consentire ai ricercatori di caratterizzare il carico vesticolare ed esplorare i loro meccanismi di comunicazione intracellulare. Questa tecnica consente una separazione sufficiente di EV e proteine extracellulari da terreni di coltura cellulare condizionati che è semplice e facile da usare. Per iniziare posizionare PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Osservare il controllo e i flaconi di coltura cellulare trattati con tunicamicina al microscopio composto con una lente obiettivo 10 x e 100 x. Prendi nota di eventuali differenze tra i palloni. Rimuovere il mezzo dal pallone e metterlo in un tubo da 50 millilitri.
Quindi centrifugare il tubo a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il super natante in un nuovo tubo. Centrifugare il tubo a 2000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il super natante in un nuovo tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Prendi quattro unità di ultrafiltrazione da 15 millilitri e tre kilodalton e aggiungi cinque millilitri di PBS a ciascun tubo. Innescare i filtri centrifugando le unità a 4.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il PBS dalle unità, dividere il surnatante dalle condizioni di controllo e trattate in due unità di ultrafiltrazione ciascuna con circa 12,5 millilitri di fluido ciascuna.
Centrifugare i tubi a 4.000 G per un'ora e 45 minuti a quattro gradi Celsius o fino a quando il mezzo concentrato o il retentato in ciascuna unità è concentrato a 250 microlitri o meno. Trasferire il retentato da entrambe le unità di controllo in un micro tubo da centrifuga da 1,5 millilitri etichettato e dalle unità trattate in un altro tubo. Misurare il volume totale del retentato in ogni micro tubo di centrifuga.
Se il volume è inferiore a 500 microlitri, aggiungere PBS filtrato da 0,22 micron fino a quando il volume finale è di 500 microlitri. Mettere i tubi in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Accendere il raccoglitore automatico di frazioni o AFC.
Rimuovere la colonna da quattro gradi Celsius e lasciare che la colonna si riscaldi a temperatura ambiente. Rimuovere i campioni retentati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e metterli sul ghiaccio per scongelare, durante l'attesa, impostare otto tubi etichettati da 1,5 millilitri nel carosello AFC con coperchi rivolti verso l'interno. Inserire la colonna nell'AFC con il codice a barre rivolto verso il lettore e regolare le impostazioni per raccogliere otto frazioni di 500 microlitri ciascuna e buffer volume di default.
Quindi verificare le istruzioni visualizzate per avviare la raccolta. Dopo che il buffer di archiviazione è stato completamente assorbito nella parte superiore della matrice di colonne. Iniziare a lavare la colonna aggiungendo 15 millilitri di PBS alla colonna.
Non aggiungere PBS troppo presto in quanto diluirebbe il buffer di archiviazione e impedirebbe un adeguato svuotamento. Poco prima che tutti i 15 millilitri di PBS vengano assorbiti dalla matrice, fare clic su OK per interrompere il lavaggio e rimuovere qualsiasi PBS residuo dalla parte superiore della matrice della colonna con una micro pipetta. Non toccare la matrice.
Aggiungere 500 microlitri di campione al centro della colonna e fare clic su OK per iniziare l'esecuzione. Dopo che il campione è stato completamente assorbito nella matrice, aggiungere immediatamente otto millilitri di PBS alla colonna. AFC dissipa automaticamente il volume di vuoto al centro della giostra prima di raccogliere tutte le otto frazioni di 500 microlitri ciascuna.
Dopo la corsa, rimuovere le frazioni dalla giostra e posizionarle sul ghiaccio. Quindi rimuovere il volume vuoto dal centro della giostra. Quindi, aggiungere 10 millilitri di PBS alla colonna per lavare qualsiasi campione residuo dalla colonna.
E una volta che il campione pentito è stato completamente lavato aggiungere 15 millilitri di PBS alla colonna. Mentre il PBS finale viene assorbito dalla matrice, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio 0,5 molare al centro della matrice della colonna. Quindi, quando l'idrossido di sodio viene assorbito, aggiungere 30 millilitri di PBS alla colonna e lasciarlo sciacquare.
Una volta fatto con tutti i campioni, conservare la colonna per un uso successivo aggiungendo 15 millilitri di azoturo di sodio allo 0,05% alla colonna. Lasciare circa cinque millilitri di azoturo di sodio sulla parte superiore della matrice della colonna. Rimuovere la colonna dall'AFC e fissare i cappucci superiore e inferiore prima di posizionare la colonna a quattro gradi Celsius per la conservazione.
Costruire l'unità di ultra filtrazione. Ottenere due millilitri, tre unità di ultrafiltrazione kilodalton cutoff per campione. Ogni unità è composta da tre parti, cono, filtro e flusso attraverso il cilindro.
Etichettare correttamente ogni parte. Aggiungere un millilitro di PBS alla porzione filtrante e tappare con il pezzo di cono. Centrifugare il cono dell'unità di ultrafiltrazione rivolto verso l'alto a 3.500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il PBS filtrato dal flusso attraverso il cilindro.
Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione e centrifugare per due minuti a 1000 G a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali PBS rimanenti. Combinare quattro 500 microlitri di ogni frazione e aggiungerli all'unità di ultrafiltrazione. Quindi le colonne di centrifuga coincidono per un'ora, 45 minuti a 3.500 G a quattro gradi Celsius o fino a quando il livello di retentato è a 100 microlitri.
Rimuovere il flusso attraverso il cilindro ed eliminare il flusso attraverso. Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione e centrifugare per due minuti a 1000 XG a quattro gradi Celsius. Trasferire il retentato nel cono in un tubo da 1,5 millilitri e rendere il volume del campione a 150 microlitri con PBS filtrato da 0,22 micron prima di posizionare i tubi in meno 80 gradi Celsius congelatore.
Un blocco occidentale rappresentativo di singole frazioni ha mostrato una forte espressione di CD9, CD63 e CD81. Infrazioni da uno a quattro con poca o nessuna espressione infrazioni da cinque a otto. Nessuna espressione di GM130 o calnexina è stata osservata in nessuna frazione.
L'albumina era presente solo nelle frazioni da sei a otto. È stata inoltre valutata l'efficacia della concentrazione delle frazioni EV e proteiche. L'espressione di CD9 e CD63 è stata osservata nei lisati cellulari.
Tutte e tre le proteine CD erano presenti nelle frazioni EV di controllo e nei campioni trattati con tunicamicina, ma non nelle frazioni proteiche. Il gene di suscettibilità tumorale 101 era presente nei lisati cellulari, ma non nelle frazioni EV o proteiche. Il GM130 e la calnexina sono stati osservati solo nei lisati cellulari.
Nella macchia occidentale dei terreni di coltura cellulare impoveriti degli esosomi, i marcatori EV erano presenti nei lisati cellulari ma non nei campioni di media. L'espressione di albumina è stata osservata nelle frazioni proteiche e l'espressione minima nei lisati cellulari. Le osservazioni TEM hanno dimostrato strutture sferiche nelle frazioni EV di controllo e campioni trattati con tunicamicina.
Queste strutture non sono state osservate in nessuna delle frazioni proteiche del tipo campione. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle rivela differenze nelle concentrazioni di particelle di controllo e nelle frazioni trattate nelle frazioni EV rispetto al controllo, leggermente più particelle erano presenti nel trattamento con tunicamicina. Tuttavia, nelle frazioni proteiche, sono state rilevate meno particelle rispetto alle EV.
È importante avere lo stesso volume di campione per le condizioni di controllo e trattate, consentendo un facile confronto delle EV dei diversi trattamenti. Dopo aver separato le EV dai terreni di coltura cellulare della condizione, possiamo caratterizzare il contenuto di proteine, RNA e lipidi delle vescicole con il sequenziamento dell'RNA proteomico e la lipidomica.
