細胞外小胞をコンディション細胞培養培地のような液体から分離することで、研究者は小胞貨物の特性評価を行い、細胞内コミュニケーションメカニズムを探索することができます。この技術により、馴化細胞培養培地からEVと細胞外タンパク質を十分に分離することができ、簡単で使いやすいものになります。まず、PBSを摂氏37度の水浴に入れます。
コントロールおよびツニカマイシン処理された細胞培養フラスコを、10 xおよび100 x対物レンズを備えた複合顕微鏡で観察します。フラスコ間の違いをメモします。フラスコから培地を取り出し、50ミリリットルのチューブに入れます。
次に、チューブを摂氏4度で5分間500Gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。チューブを2000Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
4つの15ミリリットル3キロダルトンカットオフ限外ろ過ユニットを取り、各チューブに5ミリリットルのPBSを追加します。ユニットを4, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離して、フィルターをプライミングします。ユニットからPBSを除去した後、対照および処理条件からの上清を、それぞれ約12.5ミリリットルの培地を含む2つの限外ろ過ユニットに分割します。
チューブを摂氏4度で1時間45分間、または各ユニットの濃縮培地または保持液が250マイクロリットル以下に濃縮されるまで、チューブを4, 000 Gで遠心分離します。両方のコントロールユニットからラベルの付いた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに保持液を移し、処理されたユニットから別のチューブに移します。各マイクロ遠心チューブ内の保持液の総容量を測定します。
容量が500マイクロリットル未満の場合は、最終容量が500マイクロリットルになるまで0.22ミクロンのろ過PBSを追加します。チューブをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。自動フラクションコレクターまたはAFCをオンにします。
カラムを摂氏4度から取り外し、カラムを室温まで温めます。マイナス80°Cの冷凍庫から保持液サンプルを取り出し、氷の上に置いて解凍し、待っている間、蓋を内側に向けてAFCカルーセルにラベルの付いた1.5ミリリットルのチューブを8本セットします。バーコードをリーダーに向けてカラムをAFCに挿入し、設定を調整して、それぞれ500マイクロリットルの8つの画分を収集し、バッファー量をデフォルトにします。
次に、画面の指示に従ってコレクションを開始します。貯蔵バッファがカラムマトリックスの上部に完全に吸収された後。カラムに15ミリリットルのPBSを加えて、カラムのフラッシュを開始します。
PBSを追加するのは早すぎます。保存バッファが希釈され、適切なフラッシングが妨げられるためです。15ミリリットルのPBSがすべてマトリックスに吸収される直前に、[OK]をクリックしてフラッシングを停止し、マイクロピペットでカラムマトリックスの上部から残留PBSを取り除きます。マトリックスには触れないでください。
カラムの中央に500マイクロリットルのサンプルを追加し、[OK]をクリックして実行を開始します。サンプルがマトリックスに完全に吸収されたら、すぐに8ミリリットルのPBSをカラムに加えます。AFCは、それぞれ500マイクロリットルの8つの画分をすべて収集する前に、ボイドボリュームをカルーセルの中心に自動的に払いのけます。
実行後、カルーセルからフラクションを取り出し、氷の上に置きます。次に、カルーセルの中心からボイドボリュームを削除します。次に、10ミリリットルのPBSをカラムに追加して、カラムから残っているサンプルを洗い流します。
そして、悔い改めたサンプルが完全に洗い流されたら、15ミリリットルのPBSをカラムに加えます。最終的なPBSがマトリックスに吸収されるので、カラムのマトリックスの中心に500マイクロリットルの0.5モル水酸化ナトリウムを加えます。次に、水酸化ナトリウムが吸収されたら、30ミリリットルのPBSをカラムに加え、洗い流します。
すべてのサンプルが終わったら、15ミリリットルの0.05%アジ化ナトリウムをカラムに追加して、後で使用するためにカラムを保存します。カラムマトリックスの上部に約5ミリリットルのアジ化ナトリウムを残します。AFCからカラムを取り外し、上部と下部のキャップを取り付けてから、カラムを摂氏4度に配置して保管します。
限外ろ過ユニットを構築します。サンプルあたり2ミリリットル、3キロダルトンのカットオフウルトラフィルトレーションユニットを入手してください。各ユニットは、コーン、フィルター、フロースルーシリンダーの3つの部分で構成されています。
各パーツに適切なラベルを付けます。フィルター部分に1ミリリットルのPBSを追加し、コーンピースでキャップします。限外ろ過ユニットコーン側を3, 500Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、ろ過されたPBSをフロースルーシリンダーから取り出します。
限外ろ過ユニットを逆さまにし、摂氏4度で1000 Gで2分間遠心分離して、残っているPBSを取り除きます。各画分の4つの500マイクロリットルを混ぜ合わせ、それらを限外濾過装置に加える。次に、遠心分離機カラムを摂氏4度で3, 500 Gで1時間45分、または保持液レベルが100マイクロリットルになるまで一致させます。
シリンダーを通る流れを取り除き、流れを捨てます。限外ろ過ユニットを逆さまにし、摂氏4度で1000XGで2分間遠心分離します。コーン内の保持液を1.5ミリリットルのチューブに移し、0.22ミクロンのろ過PBSでサンプル量を150マイクロリットルにしてから、チューブを摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れます。
個々の画分の代表的な西部ブロックは、CD9、CD63、およびCD81の強い発現を示した。1 から 4 の違反 式がほとんどまたはまったくない 5 から 8 の違反。GM130またはカルネキシンの発現は、いずれの画分においても観察されなかった。
アルブミンはフラクション6〜8にのみ存在していました。EVおよびタンパク質画分を濃縮することの有効性も評価した。CD9およびCD63の発現は、細胞溶解物において観察された。
3つのCDタンパク質はすべて、コントロールおよびツニカマイシン処理サンプルのEV画分には存在していましたが、タンパク質画分には存在しませんでした。腫瘍感受性遺伝子101は細胞溶解物中に存在したが、EVまたはタンパク質画分には存在しなかった。GM130とカルネキシンは細胞溶解物でのみ観察されました。
エキソソーム枯渇細胞培養培地のウェスタンブロットでは、EVマーカーは細胞溶解液には存在しましたが、培地サンプルには存在しませんでした。アルブミン発現はタンパク質画分において観察され、細胞溶解物では最小限の発現が観察された。TEM観察は、対照およびツニカマイシン処理サンプルのEV画分に球状構造を示しました。
これらの構造は、いずれのサンプルタイプのタンパク質画分においても観察されなかった。ナノ粒子追跡分析は、対照と比較してEV画分における対照および処理画分の粒子濃度の違いを明らかにし、わずかに多くの粒子がツニカマイシン処理中に存在した。しかし、タンパク質画分では、EVに比べて検出される粒子が少なかった。
異なる処理からのEVを簡単に比較できるように、対照条件と処理条件のサンプル量を同じにすることが重要です。コンディション細胞培養培地からEVを分離した後、プロテオミクスRNAシーケンシングとリピドミクスを使用して、小胞のタンパク質、RNA、脂質含有量を特徴付けることができます。
