Bu protokol sadece farklı ölçeklerde kültürden veziküllerin arındırılması için yaklaşımlar, ödünleşimler, metodolojiler arasındaki farklılıklar ve aynı zamanda saha örnekleriyle çalışmak için dikkate alınması gereken yaklaşımları göstermesi açısından önemlidir. Siyanobakteriler benzersiz vezikül örnekleme ve analiz zorlukları sunar. Bu teknikler, vezikülleri kültürden ve çevresel örneklerden başarıyla izole etmiş ve yoğunlaştırmıştır.
500 mililitreden daha az numuneleri konsantre etmek için, 15 ila 20 mililitrelik ultrafiltrasyon santrifüj konsantrifüjlü konsantratörlerin Tip 1 ultra saf dereceli suyla durulanması ile başlayın. Konsantratörleri santrifüje yükleyin ve dört santigrat derecede 4.400 x g'de döndürün. Çalıştırmayı atın ve adımı en az iki kez tekrarlayın.
Süper natant numuneyi suyla durulanmış bir yoğunlaştırıcıya yükleyin ve aynı koşullar altında döndürün. Numune 15 ila 30 mililitrelik son bir hacme konsantre olana kadar bu adımı tekrarlayın. 500 mililitreden fazla bir hacme konsantre olmak için, aparatı makalede açıklandığı gibi kurarak teğetsel akış filtrasyonu gerçekleştirin.
Giriş hattına peristaltik bir pompa takın ve ayarlanabilir kelepçeleri retentat hattına yerleştirin. Teğetsel akış filtrasyonunu makalede açıklandığı gibi sterilize edin, ardından cihazı bir litre Tip 1 ultra saf dereceli suyla yıkayın. Numune haznesine 0,2 mikrondan az filtrat ekleyin.
Filtrat hatlarından çıkışı artırmak için retentate hattındaki pompa hızını ve geri basınç seviyelerini yavaşça artırın. Teğetsel akış filtrasyonunu çalıştırmaya devam edin ve malzeme çıkarıldıkça rezervuarı kültür süpernatantı ile doldurun. Rezervuardaki hacim, hava kabarcıkları sokmadan giriş hattına akışı sürdürmek için gereken mümkün olan en düşük miktara ulaştığında numuneyi yoğunlaştırmayı bırakın.
Çıkış çizgisini bir kelepçe ile kapatın. Retentate hattı üzerindeki geri basıncı kaldırın. Konsantre süpernatantı filtreden 10 dakika boyunca yeniden dolaştırın, geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için devridaim hızını dakikada 20 ila 40 mililitre arasında azaltın.
Retentat hattını temiz bir kaba taşıyın, giriş hattını numuneden çıkarın ve konsantre malzemeyi toplayın. Pipet kullanarak numune haznesinde kalan malzemeleri geri kazanın. Konsantre süpernatantı 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün.
Gerekirse, vezikül saflaştırmaya geçmeden önce son konsantreyi yaklaşık üç hafta boyunca dört santigrat derecede saklayın. Konsantre kültür numunesini peletlemek için temiz bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpün doldurulduğundan emin olmak için temiz ortam veya tampon ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir pipetle çıkarın.
Pelet edilmiş malzemeyi taze kültür ortamı veya 1X fosfat tamponlu salin gibi yıkama tamponu ile tekrar yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bir mililitrelik pipetle nazik pipetleme yaparak taze kültürdeki son peleti yeniden askıya alın ve temiz bir kaba aktarın. Yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme yapmak için, makalede açıklandığı gibi iyodiksantal stokları hazırlayın.
% 45'lik bir iyodiksanol çözeltisi oluşturmak için 4X tamponunun bir kısmını% 60 iyodiksanol stoğunun üç kısmı ile karıştırın. 40, 35, 30, 25, 20, 15 ve% 10 nihai iyodiksanol konsantrasyonlarının gradyan ortam stoklarını oluşturmak için% 45 iyodiksanol ile 1X tampon ile seyreltin. Daha sonra, tüm bu iyotiksanol gradyan stoklarının eşit miktarlarını, tüm tüp hacmini kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne dikkatlice yerleştirin.
Santrifüjlemeden sonra, her biri yaklaşık 4,5 mililitrelik bir gradyan için 0,5 mililitrelik fraksiyonları, dikkatlice pipetleyerek veya bir fraksiyon toplayıcı kullanarak toplayın. Analitik terazi ve kalibre edilmiş pipet kullanarak her fraksiyonun yoğunluğunu mililitre başına gram cinsinden belirleyin. Numuneyi tüpten çıkarın, ağırlığı belirleyin ve numuneyi tüpe geri verin.
Tek tek fraksiyonları yeni bir tüpte temiz tamponla seyreltin, ardından temiz bir ortam veya tampon yıkama yapın. Dikkatlice beş mikrolitre vezikül uygulayın ve beş dakika bekletin. Bir ızgaranın kenarına bir parça temiz filtre kağıdına dokunarak numuneyi çıkarın.
Plastik filmle kaplı düz bir yüzeye 20 ila 50 mikrolitre %2 uranil asetat pipet verin. Ardından ızgarayı iki dakika boyunca üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı kullanarak uranil asetatı çıkarın ve yıkamak için bir damla ultra saf su üzerinde kısa bir süre yüzün.
Temiz bir şırınga kullanarak odayı ultra saf suyla doldurun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kamerayı başlat'a tıklayın ve parmak izinin etrafındaki odanın en uygun bölgesini görselleştirin. Ekran kazancı ve kamera seviyesi kaydırıcılarını maksimuma doğru kaydırın, ardından en soluk parçacıkları görmek için en düşük seviyeye düşürün.
Partiküllerin görüş alanı boyunca kabaca eşit derecede görünür olmasını sağlamak için odağı gerektiği gibi ayarlayın ve oda temizlenene kadar ultra temiz suyla yıkamaya devam edin. Vezikül örneğini bir mililitrelik bir şırınga kullanarak odaya ekleyin ve alım ayarlarını onaylayın. SÇP açılır kutusundan 'standart ölçüm'ü seçin ve ayarları değiştirerek her biri 60 saniyelik videolardan oluşan en az üç teknik kopya toplayın.
'Komut dosyası oluştur' tuşuna basın ve istemleri izleyin ve yaklaşık 100 mikrolitre numuneyi çoğaltmalar arasındaki odaya itin. 'Analiz'e tıklayarak partikül parametrelerini belirleyin ve deneyi açın ve örnek dosyayı yükleyin. Seçilen dosyaları işle'yi seçin ve analizin tamamlanmasını bekleyin.
Siyanobakteri Synechocystis sp. PCC6803'ten hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu, dış zarın, ultrasantrifüjleme yoluyla doğrudan peletleme yoluyla toplanan vezikül örneklerine karakteristik turuncu renklenme sağlayan karotinoidler içerdiğini göstermiştir. Resudükte vezikül peleti, transmisyon elektron mikroskobu ile uranil asetat ile numuneleri negatif boyayarak veya ultra ince kesitleri gözlemleyerek incelendi.
Vezikül boyutu dağılımı ve konsantrasyonu, dinamik ışık saçılması ve nanopartikül izleme analizleri kullanılarak değerlendirildi. Saflaştırılmış Synechocystis sp. PCC6803 vezikülleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı ve lipopolisakkaritler için boyandı.
Teğetsel akış filtrasyonunun çalıştığından ve veziküllerin yoğunlaştığından emin olmak için konsantre vezikül numunesinden önce ve sonra numuneler alınmalıdır. Daha sonra nanopartikül izleme analizini kullanarak her iki numuneyi de ölçmeniz gerekir. Küçük parçacıkların kültür ve çevresel numunelerden ayırt edilmesini ve izolasyonunu iyileştirmek için bu yöntemi boyut dışlama kromatografisi veya asimetrik alan akışı fraksiyonasyonu gibi diğer yaklaşımlarla birleştirmek için gelecekteki çabalar gereklidir.
Bu teknik, siyanobakteri veziküllerini ve bu veziküllerin siyanobakteriyel biyolojideki spesifik fonksiyonel rollerini incelemek için yararlıdır.
