Serebellar Organoidler'de elde edilen IPS hücrelerinin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar ve tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak ilk kez yeni bir yaklaşım saklıyız. Biyo-reaktörün tohumlanması için hücre elde etmek için, insan iPSC'nin altı kuyu plakasının her kuyusuna bir mililitre hücre ayırma ortamı ekleyin. Plakayı 7 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ta ki hafif sallayarak hücreleri kuyudan kolayca ayırana kadar.
P 1000 mikropipet kullanarak, hücreler tek hücrelere ayrışana kadar hücre ayırma ortamını yukarı ve aşağı boruhaline getirin. Sonraki iki mililitre ekleyin, her iyi tam hücre kültürü orta, bu enzimatik sindirim inaktive edecektir. Sonra yavaşça steril konik bir tüp hücreleri aktarmak için, pipet kullanın.
Tüpü 210 kez yer çekiminde üç dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve kültür orta hücre pelet yeniden askıya alın. Hücreleri hemositometre kullanarak ve mavi boyayı deneyin.
Mililitrebaşına 250,000 hücre yoğunluğunda iPSC'li biyoreaktör kabına bakın. Biyoreaktör kabını, 37 santigrat derece, %95 nem ve %5 karbondioksit le bir kuvözde, Evrensel Baz Ünitesi'ne yerleştirin. iPSC toplamayı teşvik etmek için, Temel Kontrol Ünitesi'nin ajitasyon oranını 27 RPM olarak ayarlayın.
İlk gün, sıfır ın biyoreaktörü tohumlama günü olduğu için, biyoreaktörü ve Baz Ünitesini steril bir akış başlığına yerleştirin, sonra bir mililitrelik numune toplamak için serolojik pipet kullanın, hücre süspansiyonundan. Plaka hücre süspansiyon ultra düşük eki, 24 iyi plaka. iPSC kaynaklı agregaların oluştuğunu doğrulamak için bir mikroskop kullanın.
Eğer öyleyse, 40 X veya 100 X.Up iPSC ve biyoreaktör, agregaların ortalama çapı kadar, 100 mikrometre, sonra taze MT01 ile kaya inhibitörü olmadan orta% 80 değiştirin, kültüre devam agregaların görüntüleri yakalamak. Agregalar 200 ila 250 mikro metre çapa ulaştığında, biyoreaktörün en altında tüm organoidlerin yerleşmesine izin verin, sonra harcanan tüm ortamı gfCDM farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Baz ünitesini ve biyoreaktörü kuvöze yerleştirin ve ajitasyonu 25 RPM'ye düşürün.
Depolanan organoidler supernatant çıkardıktan sonra, pelet için% 15 sakaroz bir mililitre ekleyin ve yavaşça girdap tarafından iyice karıştırın. Bir gecede organoidler kuluçka sonra, dört derece santigrat, sakaroz çözeltisi kaldırmak, sonra% 15 sakaroz bir mililitre ekleyin, 7.5% jelatin, ve yavaşça girdap tarafından hızlı bir şekilde karıştırın. Organoidler 37 santigrat derecede kuluçkaya yatarken plastik bir kabı %15 sakaroz %7.5 jelatin çözeltisi ile yarıya kadar doldurur ve katılaşmasını sağlar.
Organoidler bir saat kuluçka yadadıktan sonra, katılaşmış sakaroz ve jelatin üzerine organoid sakaroz jelatin karışımı bir damla yerleştirmek için, bir Pasteur pipet kullanın. Damlanın katılaşması için 15 dakika bekledikten sonra, plastik kabın geri kalanını %15 daha fazla sakaroz, %7,5 jelatin le doldurun, oda sıcaklığında tamamen katılaşmasını bekleyin ve ardından 4 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bir küp halinde jelatin kesin, merkezinde organoidler ile, karton bir parça küp düzeltmek, OCT bileşik bir damla ile, sonra Isopentane 250 mililitre yerleştirilir, 500 mililitrelik fincan içinde, sıvı nitrojen ile uygun bir kap doldurun.
Forceps ve kalın eldiven kullanarak, dikkatle Sıvı nitrojen yüzeyine, Isopentane fincan yerleştirin. Isopentane ve sıvı nitrojenler, tehlikeli reaktiflerdir. Bu iki reaktifkullanımı, kalın eldiven ve yeterli havalandırma da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman gerektirir.
Isopentane, negatif 80 santigrat dereceye soğuduktan sonra jelatin küpü donana kadar Isopentane'ye yerleştirin. İyi donmuş bir küp, hafifçe kirişlerle dokunduğunda metalik bir ses üretir ve depoya hazır olduğunu gösterir. 50 mililitre 1X PBS ile organoid kesitleri içeren mikroskop slaytlarını beş dakika yıkayın ve slaytları taze 1X PBS içeren coplin kavanozuna aktarın.
Slaytları, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 mililitre taze hazırlanmış glisin ve kuluçka içeren Coplin kavanozuna aktarın, ardından slaytları %0,1 Triton'un 50 mililitresini içeren coplin kavanozuna aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika geçirin. Slaytları her seferinde beş dakika boyunca 1X PBS ile iki kez yıkayın. 1X PBS'de ıslatılmış üç milimetrelik kağıtla immünboyama kabını hazırlayın.
Dilimlerin her yerine bir doku ile slaytlar kuruve üç milimetrelik kağıt üzerine yerleştirin. Pasteur pipetiyle, her slaytı 0,5 mililitre engelleme çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkadan sonra, fazla engelleme çözeltisini çıkarın ve dilimlerin her yerinde bir doku ile slaytları sürükleyin.
Her slayt üzerine seyreltilmiş primer antikor 50 mikrolitre yerleştirin ve kapak fişleri ile kaplayın. Dantel slaytlar, daha önce hazırlanmış immunostaining çanak, ve dört derece santigrat onları kuluçka. Bir gece kuluçka sonra, bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın, TBST 50 mililitre ile, kapak fişleri düşmesine izin, sonra TBST ile slaytlar üç kez yıkamak, beş dakika her zaman.
Her slaytüzerine seyreltilmiş ikincil antikor 50 mikrolitre yerleştirin ve kapak fişleri ile kaplayın. Slaytlar yerleştirin, önceden hazırlanmış immunostaining çanak, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka, ışıktan korunan. Slaytları tekrar Coplin kavanozuna aktarın ve her seferinde beş dakika boyunca 50 mililitre TBST ile üç kez yıkayın.
Pasteur Pipeti kullanarak, 0,5 mililitre dappy çözeltisi, her slayt tüm yüzeyüzerinde ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka. Biyoreaktörde 24 saat kaldıktan sonra, iPSC'nin verimli bir şekilde oluşan küresel şekilli agregaları. Morfolojisi beşinci güne kadar bakımlıydı ve boyutu nda kademeli bir artış oldu.
Yüksek derecede homojenlik gösteriyor. Mikroskopi ile yapılan kantitatif analiz, aynı zamanda normal dağılım ortaya, ilk güne kadar toplam boyutları, ve her iki hücre hatları gün iki optimum toplam boyutuna ulaştı. İstenilen agrega çapı sağlandıktan sonra nöral bağlılık başlatıldı ve daha sonra farklı serebellar ataların üretimi teşvik edildi.
Diferansiyasyon organoidleri sırasında, luminal alana sahip nöral tüp benzeri yapılara benzer daha belirgin bir epitelizasyon gösterdi. Ayrıca organoid çap dağılımı, 14. İmmünofloresans analizi destekler, etkili bir nöral bağlılık, iPSC türetilmiş organoidler, zaten elde edilir, farklılaşma gün yedi.
İmmünostaining de gösterdi, etkin serebellar bağlılık ve serebellar organoidlerin verimli olgunlaşma. Ayrıca, biyoreaktörde 80 gün sonra, organoidlerin canlı ölü boyama yüksek hücre canlılığı gösterdi, ve nekrotik alanlarda hiçbir kanıt. Bu teknik önemli bir aracı temsil eder, patolojik yollar incelenmesi için, serebellar dejenerasyonu gözlenen ve yeni ilaçların terapötik etkisini değerlendirmek için rol.
