Bu yöntem, erken insan serebellar gelişimini ve nöropsikiyatrik bozukluklarda nasıl değiştirilebileceğini incelemede yardımcı olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajı, karmaşık adımlar atmadan 2D katman yapısında gelişimsel olarak erken insan serebellar hücreleri oluşturmaktır. Aynı zamanda uygun maliyetlidir.
Başlangıçta çekme pipetleri yapmak zor olabilir, ancak pratik ve zamanla pipetleri çalışmak daha kolay olacak şekilde çekmek kolaylaşır. İki cam pipet oluşturmak için boynun yaklaşık iki santimetre altında, bunsen brülörün üzerinde 22,9 santimetrelik bir Pasteur pipet çekerek deneysel hazırlığa başlayın. Daha ince taraf diğerinden yaklaşık dört santimetre daha kısa olacaktır.
Pürüzsüz bir R oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını alev üzerinde bükün, ardından çekilen pipetleri otoklav manşonlarına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin. Sıfır gününde, altı kuyucuklu ultra düşük bir ataşman veya ULA, plakanın her bir kuyucuğuna 10 mikromolar Y-27632 ve SB-431542 ile desteklenmiş bir mililitre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin. Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin.
Ortamı aspire edin ve her 35 milimetrelik çanak için bir milimetre iPSC passaging solüsyonu ekleyin. 37 santigrat derecede üç dakikalık inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve 10 mikromolar Y-27632 ve SB-431542 ile desteklenmiş iki milimetre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin İletilen ışık ters çevrilmiş bir mikroskobun 4x büyütülmesi altında, çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak tüm kolonileri altı kuyucuklu ULA plakasının bir kuyucuğuna yavaşça aktarın.
Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın ve hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, mililitre başına 50 nanogramlık bir son konsantrasyonu ayarlamak için her bir kuyucuğa FGF2 ekleyin. Yedinci günde, bir mililitre harcanmış ortamı aspire ederek ve bir mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ile değiştirerek ortamın üçte birini değiştirin.
Embriyoid cisimleri yedi gün boyunca inkübe edin. 14. günde, tüm embriyoid cisimleri plakanın merkezinde toplamak için plakayı döndürün. Ardından plakayı eğin ve kenardan 1000 mikrolitrelik bir pipetter kullanarak harcanan tüm ortamı aspire edin.
Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yerleştirin ve aspire etmeye devam edin, embriyoid cisimleri dışarı çekmekten kaçınmak için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş üç mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ekleyin. Daha sonra embriyoid cisimleri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak Poli-L-Ornitin Laminin kaplı bir kaba aktarın.
15. günde, ortamı aspire edin ve taze serebellar farklılaşma ortamı ile değiştirin. Sıfır gününde, iPSC kolonileri temizlendi ve SB-431542 ve Y-27632 içeren serebellar farklılaşma ortamına kaldırıldı ve embriyoid cisimler oluşturmak için ultra düşük bağlantı plakalarına yerleştirildi. İkinci günde FGF2 ilavesi ve yedinci günde 1/3 ortamın değişmesi, embriyoid cisimlerin 14. günde genişleme göstermesine neden oldu.
Hücreler, 15. günde kaplanmış yüzey boyunca embriyoid cisimlerden dışarı doğru göç etmeye başladı. Ortamın 21. günden itibaren serebellar olgunlaşma ortamına tamamen değişmesi, 35. güne kadar nöronal benzeri morfolojiye ve karmaşıklığa sahip tek katmanlı bir hücre tabakası ile sonuçlandı. 35. gündeki gen ekspresyon analizi, hücrelerin glutamaterjik progenitörler, ATOH1, GABAerjik progenitörler, PTF1 alfa ve Purkinje progenitör hücre belirteçleri KIRREL2 ve SKOR2 gibi erken serebellar progenitör belirteçleri eksprese ettiğini ortaya koymuştur.
Ek olarak, eşkenar dörtgen dudak belirteci OTX2 ve çoğunlukla anterior nörona özgü SIX3'ün ekspresyonu da gözlendi. 35. günde toplanan hücrelerin immünofloresan etiketlemesi, beyincik belirteçleri EN2 ve PTF1 alfa, nöronal belirteç beta tübülin III ve proliferasyon belirteci KI67 için pozitif boyanma gösterdi. 4'6-diamidino-2-fenilindol veya DAPI ile nükleer boyama, hücre çekirdeği gösterdi.
Başarılı bir farklılaşma için, sağlıklı ve farklılaşmamış iPSC kolonileri ile başlamak ve mümkün olduğunca taze bir şekilde yeniden oluşturulmuş reaktifler kullanmak çok önemlidir.
