人类多能干细胞和免疫损伤的成熟小脑有机体可伸缩生成

我们首次提出了一种可重复和可扩展的生成新方法，即在小脑有机体中衍生的 IPS 细胞，以及使用一次使用生物反应器的化学定义条件。为了获得用于播种生物反应器的细胞，在人类 iPSC 六井板的每个井中加入一毫升细胞分离介质。在37摄氏度下孵育板7分钟，直到轻轻的震动很容易将细胞从井中分离。

使用P 1000微移液器，上下移液细胞分离介质，直到细胞分离成单个细胞。接下来添加两毫升，完整的细胞培养培养培养能力到每个井，这将灭活酶消化。然后使用移液器，轻轻地将细胞转移到无菌锥形管中。

在重力210倍时将管离心三分钟。取出上一提液，并在培养培养中重新悬浮细胞颗粒。使用血细胞计计算细胞数，并尝试蓝色染料。

见生物反应器容器与 iPSC 的，密度为每毫升25万细胞。将生物反应器容器插入通用基座单元，放入37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳的孵化器中。要促进 iPSC 聚合，请将基本控制单元的搅拌速率设置为 27 RPM。

第一天，第1天是播种生物反应器的日子，将生物反应器和基础单元放在无菌流罩中，然后使用血清移液器，收集一毫升样品，细胞悬浮液。将电池悬浮板放在超低附件中，24个井板。使用显微镜，确认 iPSC 衍生的聚合已经形成。

如果是这样，以40 X或100 X捕捉集料的图像。当集料，达到200至250微米的直径，让所有的器官沉淀，在生物反应器的底部，然后更换所有花费的介质，与g方体分型介质。将基座和生物反应器放在培养箱中，将搅拌降低至 25 RPM。

从储存的有机物中去除上经剂后，在颗粒中加入1毫升15%蔗糖，然后轻轻旋转，混合均好。在四摄氏度下孵育有机体后，取出蔗糖溶液，然后加入15%蔗糖、7.5%明胶的一毫升，然后轻轻旋转快速混合。当有机体在37摄氏度下孵育时，用15%蔗糖7.5%明胶溶液填充一个塑料容器，并允许其凝固。

在有机体孵育一小时后，使用巴斯德移液器，将一滴有机糖明胶混合物放在凝固蔗糖和明胶上。等待15分钟后，下降凝固，填补塑料容器的其余部分，用更多的15%蔗糖，7.5%明胶，允许它完全凝固在室温下，然后在4摄氏度下孵育20分钟。将明胶切成立方体，中间有有机物，将立方体固定成一块纸板，用一滴 OCT 化合物，然后将 250 毫升异丙烷放入 500 毫升的杯子中，用液氮填充适当的容器。

使用钳子和厚手套，小心地将异丙烷杯放在液氮表面。异丙烷和液氮是危险试剂。使用这两种试剂时，需要个人防护设备，包括厚手套和充足的通风。

当异素烷冷却到负80摄氏度时，将明胶立方体放在异素烷中，直到它冻结。一个冰冻良好的立方体，在用钳子轻轻敲击时产生金属声音，表明它已准备好存储。用 50 毫升 1X PBS 清洗包含器官部分的显微镜幻灯片，5 分钟，然后将幻灯片转移到包含新鲜 1X PBS 的科普林罐中。

将幻灯片转移到含有 50 毫升新鲜准备的甘氨酸的科普林罐中，在室温下孵育 10 分钟，然后将幻灯片转移到含有 0.1%Triton 的 50 毫升的科普林罐中，并在室温下渗透 10 分钟。用 1X PBS 清洗幻灯片两次，每次洗涤 5 分钟。准备免疫浸盘子，用三毫米纸浸泡在1X PBS中。

用切片周围的纸巾擦干幻灯片，并把它们放在三毫米纸上。使用巴斯德移液器，用 0.5 毫升的阻尼溶液盖住每张幻灯片。在室温下孵育30分钟后，去除多余的阻塞溶液，用纸巾驱动幻灯片，在切片周围。

将稀释原抗体的50微升放在每张幻灯片上，用盖板盖住它们。将滑梯放在先前准备的免疫抹盘中，并在摄氏四度时孵育。经过一夜的孵育，将幻灯片转移到一个Coplin罐子，50毫升的TBST，让盖板脱落，然后用TBST洗三次幻灯片，每次5分钟。

将稀释的二次抗体的50微升放在每张幻灯片上，并盖上盖板。将幻灯片放在先前准备的免疫抹盘中，在室温下孵育30分钟，防止光线。将幻灯片再次转移到科普林罐中，用 50 毫升 TBST 洗涤三次，每次洗涤五分钟。

使用巴斯德移液器，在0.5毫升的dappy溶液，在每个幻灯片的整个表面，并在室温下孵育5分钟。在生物反应器中24小时后，iPSC有效地形成了球形状的集料。形态在第五天之前一直保持良好，尺寸逐渐扩大。

表现出高度的同质性。显微镜的定量分析还显示，第一天聚合大小的正态分布，两个细胞系在第二天达到最佳的聚合大小。在达到所需的聚合直径后，诱导神经承诺，然后生成不同的小脑祖细胞。

在分化器官过程中，显示一种更明显的上皮化，类似于具有发光空间的神经管状结构。此外，器官直径分布，在初始小脑承诺期间均匀，直到第14天。免疫荧光分析支持，一个有效的神经承诺，iPSC衍生的器官，已经实现，第七天分化。

免疫污染也证明，有效的小脑承诺和小脑器官的高效成熟。此外，在生物反应器80天后，有机物的活死染色显示出高细胞活性，并且没有证据表明坏死区。这项技术是研究病理通路的重要工具，它涉及小脑退化，并评估新药的治疗效果。