ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

我々は初めて、単回使用バイオリアクターを用いて、再現性と拡張性の高い生成、小脳オルガノイドで誘導されるIPS細胞の新しいアプローチ、および化学的に定義された条件を提示する。バイオリアクターを播種するための細胞を得るために、ヒトiPSCの6つのウェルプレートの各ウェルに、細胞剥離培地を1ミリリットル加える。穏やかな揺れがウェルから細胞を簡単に取り外すまで、37°Cでプレートを7分間インキュベートします。

P1000マイクロピペットを用いて、細胞剥離培地を、上下に、細胞が単一細胞に解離するまでピレットする。次に、完全な細胞培養培地の2ミリリットルを各ウェルに加え、酵素消化を不活性化する。次にピペットを使用して、細胞を滅菌状の円錐管に穏やかに移します。

チューブを210倍の重力で3分間遠心分離します。上清を取り除き、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁した。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、トリパンブルー染料。

iPSCの1ミリリットル当たり250,000細胞の密度でバイオリアクター容器を参照してください。バイオリアクター容器をユニバーサルベースユニットに挿入し、摂氏37度、湿度95%、二酸化炭素5%のインキュベーターに挿入します。iPSC凝集を促進するには、ベースコントロールユニットの攪拌速度を27 RPMに設定します。

1日目には、ゼロ日目がバイオリアクターを播種する日で、バイオリアクターとベースユニットを無菌フローフードに入れ、血清ピペットを使用して細胞懸濁液の1ミリリットルサンプルを採取する。細胞懸濁液を超低い取り付け、24ウェルプレートに入れます。顕微鏡を用い、iPSC由来の凝集体が形成されたことを確認する。

その場合、40 Xまたは100 X.iPSCとバイオリアクターの培養を続けるで、凝集体とバイオリアクターの平均直径が100マイクロメートルになるまで、その後、岩石阻害剤のない新鮮なMT01で培地の80%を置き換えます。凝集体が直径200〜250マイクロメートルに達すると、すべてのオルガノイドを生体反応器の底に落ち着かせ、その後、すべての使用済み培地をgfCDM分化培地に置き換えます。基底ユニットとバイオリアクターをインキュベーターに入れ、撹拌を25RPMに減らします。

保存されたオルガノイドから上清を取り除いた後、ペレットに15%スクロースの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻いてよく混ぜます。オルガノイドを一晩、摂氏4度でインキュベートした後、スクロース溶液を取り除き、15%スクロース、7.5%ゼラチンの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻くことによって素早く混ぜます。オルガノイドは摂氏37度でインキュベートしている間、15%スクロース7.5%ゼラチン溶液で途中でプラスチック容器を充填し、固化させます。

オルガノイドが1時間インキュベートされた後、パスツールピペットを使用して、凝固したスクロースとゼラチンの上にオルガノイドスクロースゼラチン混合物の滴を置く。滴が固まるのを15分待った後、プラスチック容器の残りの部分を15%以上のスクロース、7.5%ゼラチンで満たし、室温で完全に固まり、摂氏4度で20分間インキュベートします。ゼラチンを立方体に切り、中央にオルガノイドを入れ、OCT化合物を滴下して立方体を段ボールに固定し、250ミリリットルのイポペンタンを500ミリリットルのカップに入れ、適切な容器に液体窒素を充填します。

鉗子と厚い手袋を使用して、慎重に液体窒素の表面に、イポレタンのカップを置きます。イセペンタンと液体窒素は、有害な試薬である。これら2つの試薬の使用は、厚い手袋と十分な換気を含む個人的な保護具を必要とする。

イセオペンタンが80°Cの負の80度まで冷却したら、ゼラチンキューブをイセプタンに入れ、凍るまで置きます。よく凍結された立方体は、軽く鉗子で叩くと金属音を生成し、それが保存される準備ができていることを示す。オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを5分間1XPBSで5分間洗浄し、そのスライドをコプリン瓶に移し、新鮮な1X PBSを含む。

スライドをコプリン瓶に移し、調製したグリシン50ミリリットルを室温で10分間インキュベートし、スライドをコプリン瓶に移し、0.1%トリトンの50ミリリットルを含み、室温で10分間透過させた。スライドを1X PBSで2回、毎回5分間洗います。免疫染色皿を3ミリメートル紙で準備し、1X PBSに浸します。

スライドをスライスの周りのティッシュで乾かして、3ミリメートル紙の上に置きます。パスツールピペットで、各スライドを0.5ミリリットルのブロッキング溶液で覆います。室温で30分間インキュベートした後、余分なブロッキング溶液を取り除き、すべてのスライスの周りに、組織でスライドを駆動します。

各スライドに希釈された一次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップでそれらをカバーします。スライドをレースし、以前に準備した免疫染色皿で、摂氏4度でインキュベートします。一晩のインキュベーションの後、スライドをコプリン瓶に移し、50ミリリットルのTBSTでカバースリップを落とし、そのスライドをTBSTで3回洗い、毎回5分間洗います。

各スライドに希釈二次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップで覆います。スライドを入れ、あらかじめ調製した免疫染色皿に、光から保護された室温で30分間インキュベートする。スライドをもう一度コプリン瓶に移し、毎回5分間、50ミリリットルのTBSTで3回洗います。

パスツールピペットを使用して、ダッピー溶液の0.5ミリリットルで、各スライドの全表面にわたって、室温で5分間インキュベートします。バイオリアクターで24時間後、iPSCの効率的に形成されたスフェロイド状の凝集体。形態は5日目までよく維持され、サイズは徐々に増加した。

高度な均質性を実証する。顕微鏡による定量分析では、1日目の集合体サイズの正規分布も明らかにされ、両方の細胞株は2日目までに最適な集合体サイズを達成した。所望の凝集直径が達成された後、神経コミットメントが誘発され、そしてその後、異なる小脳前駆物質の生成が促進された。

分化オルガノイドの間に、発光空間を有する神経管様構造に類似した、より顕著な上皮化を示した。さらに、オルガノイド径分布は、14日目まで初期小脳コミットメントの間に均質であった。免疫蛍光分析は、iPSC由来オルガノイドの効率的な神経コミットメントが既に達成されていることを、7日目の分化によって支持する。

免疫染色はまた、実証, 効率的な小脳コミットメントと小脳オルガノイドの効率的な成熟.さらに、バイオリアクターで80日後、オルガノイドの生きた死染色は高い細胞生存率を示し、壊死領域の証拠はなかった。この技術は、病理学的経路を研究するための重要なツールを表し、新薬の治療効果を評価するために観察された小脳の変性に関与する。