אנו מציגים לראשונה, גישה חדשה לדור ניתן לשחזור ומדרגי, של תאי IPS המופקים באורגנואידים מוחיים, ותנאים מוגדרים כימיים, באמצעות ביו-רקטורים חד-משתמשים. כדי להשיג תאים לזרוע את הכור הביולוגי, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום ניתוק תאים, לכל באר של צלחת שש באר של iPSC האנושי. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות, עד רעידות עדינות בקלות מנתק את התאים, מן הטוב.
באמצעות מיקרופיפט P 1000, צינור ניתוק התא בינוני, למעלה ולמטה, עד התאים להתנתק לתאים בודדים. הבא להוסיף שני מיליליטר, של תרבות תאים מלאה בינוני לכל באר, זה יהיה להשבית עיכול אנזימטי. ואז להשתמש פיפטה, כדי להעביר בעדינות את התאים לצינור חרוט סטרילי.
צנטריפוגה הצינור ב 210 פעמים כבידה במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא במדיום תרבות. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ו לצבוע כחול trypan.
ראה את כלי הביוריאקטור עם iPSC של, בצפיפות של 250, 000 תאים למיליליטר. הכנס את כלי הביו-ריאקטור, ליחידת הבסיס האוניברסלית, באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי לקדם צבירת iPSC, הגדר את קצב התסיסה של יחידת בקרת הבסיס ל- 27 סל"ד.
ביום הראשון, כשהיום האפס הוא היום של זריעת הביו-ריאקטור, מניחים את הביו-ריאקטור, ואת יחידת הבסיס במכסה המנוע של זרימה סטרילית, ואז משתמשים בפיפלטה סרולוגית, כדי לאסוף דגימה של מיליליטר אחד, של ההשעיה של התא. צלחת ההשעיה התא בקובץ מצורף נמוך במיוחד, 24 צלחת גם. השתמש במיקרוסקופ, כדי לאשר כי אגרגטים נגזר iPSC נוצרו.
אם כן, ללכוד תמונות של אגרגטים ב 40 X או 100 X.Continue culturing של iPSC ואת bioreactor, עד הקוטר הממוצע של אגרגטים, הוא 100 מיקרומטר, ולאחר מכן להחליף 80% של המדיום, עם MT01 טרי ללא מעכבי סלע. כאשר אגרגטים, להגיע 200 כדי 250 מיקרו מטר קוטר, לתת את כל האורגנואידים להתיישב, בחלק התחתון של bioreactor, ולאחר מכן להחליף את כל המדיום בילה, עם אמצעי הבידול gfCDM. מניחים את יחידת הבסיס ואת הביוריאקטור באינקובטור ולהקטין את התסיסה ל 25 סל"ד.
לאחר הסרת העל-טבעי מהאיברואידים המאוחסנים, מוסיפים מיליליטר אחד של 15% סוכרוז לכדור, ומערבבים היטב על-ידי מערבולת עדין. לאחר הדגירה אורגנואידים לילה, בארבע מעלות צלזיוס, להסיר את פתרון סוכרוז, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 15% סוכרוז, 7.5% ג'לטין, ומערבבים במהירות על ידי מערבולת בעדינות. בעוד האורגנואידים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למלא מיכל פלסטיק באמצע הדרך עם 15% סוכרוז 7.5% פתרון ג'לטין, ולאפשר לו להתגבש.
לאחר האורגנואידים כבר דגירה במשך שעה אחת, להשתמש פיפטה פסטר, כדי למקם טיפה של תערובת ג'לטין סוכרוז אורגנואיד, על גבי סוכרוז מוצק וג'לטין. לאחר המתנה של 15 דקות עד שהירידה תתחזק, מלאו את שאר מיכל הפלסטיק, עם יותר מ-15% סוכרוז, 7.5% ג'לטין, אפשרו לו להתגבש לחלוטין בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הדגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חותכים את הג'לטין לקוביה, עם האורגנואידים במרכז, מתקנים את הקובייה לחתיכת קרטון, עם טיפה של תרכובת OCT, ואז הניחו 250 מיליליטר של Isopentane, ב 500 מיליליטר, למלא מיכל מתאים, עם חנקן נוזלי.
באמצעות מדפים וכפפות עבות, מניחים בזהירות את Isopentane, על פני השטח של החנקן הנוזלי. חנקן וחנקן נוזלי, הם רייגנטים מסוכנים. השימוש בשני רייגנטים אלה דורש ציוד מגן אישי, כולל כפפות עבות ואוורור הולם.
כאשר Isopentane, התקרר שלילי 80 מעלות צלזיוס, מניחים את קוביית הג'לטין ב Isopentane עד שהוא קופא. קוביה קפואה היטב, מייצרת צליל מתכתי כאשר טפח קלות עם מדפים, המציין כי הוא מוכן לאחסן. לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ המכיל את החלקים organoid, עם 50 מיליליטר 1X PBS במשך חמש דקות, ולאחר מכן להעביר את השקופיות לצנצנת קופלין, המכיל PBS 1X טרי.
מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין, המכילה 50 מיליליטר גליצין ודגירה טריים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין, המכילה 50 מיליליטר של 0.1% טריטון, ומחלחלת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות פעמיים עם 1X PBS, במשך חמש דקות בכל פעם. הכינו את המנה לכשל חיסוני, עם נייר של שלושה מילימטרים, ספוגה ב-PBS 1X.
מייבשים את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות ומ מניחים אותן על הנייר של שלושת המילימטרים. עם פיפטה פסטר, לכסות כל שקופית עם 0.5 מיליליטר של פתרון חסימה. לאחר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר פתרון חסימה עודף לנהוג שקופיות עם רקמה, סביב הפרוסות.
מניחים 50 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני מדולל, על כל שקופית ומכסים אותם עם תלושי כיסוי. תחרה את המגלשות, בצלחת immunostaining שהוכן בעבר, ו דגירה אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה לילה, להעביר את השקופיות לצנצנת קופלין, עם 50 מיליליטר של TBST, לתת את תלושי הכיסוי ליפול, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST, במשך חמש דקות בכל פעם.
מניחים 50 מיקרוליטרים, של נוגדן משני מדולל על כל שקופית, ומכסים עם החלקות הכיסוי. מניחים את השקופיות, בצלחת immunostaining שהוכן בעבר, דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. העבר את השקופיות לצנצנת קופלין שוב, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מיליליטר של TBST, במשך חמש דקות בכל פעם.
באמצעות פיפט פסטר, ב 0.5 מיליליטר של פתרון דאפי, על פני כל פני השטח של כל שקופית ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 24 שעות בביו-ריירקטור, אגרגטים בצורת ספרואידים שנוצרו ביעילות על-ידי IPSC. המורפולוגיה הייתה מטופחת עד היום החמישי, עם עלייה הדרגתית בגודלה.
הפגנת רמה גבוהה של הומוגניות. ניתוח כמותי של מיקרוסקופיה חשף גם התפלגות תקינה, בגדלים מצטברים לפי יום אחד, ושני קווי התאים הגיעו לגודל המצטבר האופטימלי ביום השני. לאחר שהושג הקוטר המצטבר הרצוי, הושרתה מחויבות עצבית, ולאחר מכן דור, של בני דור שלם שונים קודמו.
במהלך אורגנואידים בידול, הראה אפיתליזציה בולטת יותר דומה מבנים דמויי צינור עצבי עם מרחב זוהר. בנוסף, התפלגות קוטר האורגנואידים, הייתה הומוגנית במהלך המחויבות המוחית הראשונית עד היום ה -14. ניתוח Immunofluorescence תומך, כי מחויבות עצבית יעילה, של אורגנואידים נגזר iPSC, כבר מושגת, על ידי היום השביעי של בידול.
Immunostaining גם הפגין, מחויבות מוחית יעילה התבגרות יעילה של אורגנואידים מוחיים. יתר על כן, לאחר 80 ימים ב bioreactor, כתמים מתים חיים של אורגנואידים הראו כדאיות תאים גבוהה, ואין ראיות של אזורים נמקיים. טכניקה זו מייצגת כלי חשוב, לחקר מסלולים פתולוגיים, המעורבים בניוון המוח הקטן שנצפה בהם ולהערכת ההשפעה הטיפולית של תרופות חדשות.
