Candida albicans biyofilmler birçok biyolojik örnekler gibi ağır kendi yerli devlet opak yarı saydamdır. Bu protokollerde, açıklama yöntemleri kullanılarak, sabit bozulmamış biyofilmlerin iç yapısının optik kesitli mikroskopi ile görüntülenebildiği gösterilebilir. Basit, ucuz ve nispeten hızlı işleme adımları ile, sabit bozulmamış biyofilmler konfokal tarama floresan mikroskopisi ile 3D görüntüleme için şeffaf yapılabilir.
Bugün bu prosedürü gösteren Katie Lagree, burada bir doktora sonrası araştırmacı olacak, ve ben. 12 kuyulu bir plakada biyofilm büyümesine başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi plakayı hazırlayın. Hücre yapışması için zaman tanımak için 90 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece hava kuvözde 60 RPM orbital karıştırıcı üzerine plaka yerleştirin.
90 dakika sonra, orta ve bekar hücreleri çıkarın ve steril orta veya PBS ile yıkayın. Aşılanmış substratı önceden ısıtılmış filamentasyon ortamı içeren çok kuyulu başka bir plakaya aktarın. Plakayı 37 santigrat derece nemlendirilmiş ortam hava kuvözlerine geri döndürün ve biyofilmleri havalandırma için 60 RPM orbital karıştırma ile 48 saate kadar büyütün.
48 saatlik plakayı kuvözden alın ve kültür ortamını her numuneden çıkarın. Serum proteinlerini seyreltmek için ortamı PBS ile değiştirin ve birkaç dakika kuluçkaya yatırın. PBS çıkardıktan sonra, fiksatif ile kuyuları doldurun.
Yemeğin iç tarafları da dahil olmak üzere tüm biyofilm büyümesini batırmak için her çanağa yeterli fiksatif hacim eklenmelidir. 20 dakika boyunca yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi fiksatifi çıkardıktan sonra, PBS'yi boşaltarak ve kuyuları pbs ve gerekli lekeyi içeren bir solüsyonla hızlı bir şekilde doldurarak boyama ya hazırlanın.
Biyofilmin birkaç saniyeden fazla kurumasını veya kurumasını izin vermeyin. Çanak leke ekleyin. Gerekli leke miktarı biyofilm kütlesine bağlıdır.
Sonra bir gecede yavaş bir yörünge karıştırıcı üzerinde kapalı çanak ayarlayın ve folyo veya siyah kağıt parçası ile ışıktan korumak. Cımbız kullanarak, sabit vitraybiyofilm PBS beş mililitre 50/50 PBS-metanol 20 mililitrecam şişe içinde biyofilm yukarı bakacak şekilde aktarın. Beş dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.
Pipet ve biyofilm veya biyofilm ve şişe arasında temas önlemek için dikkatli bir atık şişesi ne çözücü çıkarın. Yavaşça düzgün metanol üç mililitre ile doldurun. Üç dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.
Şimdi bir atık şişesine çözücü çıkarın ve hemen metanol beş mililitre ile doldurun. Beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla orbital hareket ile elle karıştırdıktan sonra, atık şişe ye çözücü kaldırın. Hemen metanol üç mililitre ile doldurun.
Biyofilmler genellikle ilk görünüm daha bu noktada daha opak görünüyorsun. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen 50/50 metanol-metil salisilat beş mililitre ile doldurun. Beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.
Biyofilm bu karışık çözücüde yarı saydam olmalıdır. Çözücübir atık şişesine çıkardıktan sonra, şişeyi üç mililitre düzgün metil salisilatla hafifçe doldurun. Üç dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla yörünge hareketi ile elle karıştırın.
Beş mililitre düzgün metil salisilat ile işlemi tekrarlayın, beş ila 10 dakika boyunca bir dakika aralıklarla elle karıştırın. Bu noktada, biyofilm şeffaf olmalıdır. Çözücüü atık şişesine çıkarın ve şişeyi hemen üç mililitre düzgün metil salisilatla doldurun.
İşlenmiş biyofilm bu çözücüde stabildir. Ters bir mikroskop kullanıyorsanız, kapak lı cam alt kısmı olan solvent geçirmez bir çanak kullanın ve ters numunenin desteği için boşluk lar hazırlayın. Burada, spacers 13 milimetre silikon halkalar önceden metil salisilat bir saat için şişme nedeniyle odak sürüklenme en aza indirmek için ıslatılmış vardır.
Tıbbi sınıf silikon kare üzerinde bir biyofilm için, kare ters ve çanak metil salisilat bir havuzda bir spacer üzerine ayarlayın. Numunenin altında herhangi bir kabarcıklar önlemek için emin olun. Çanak sıkıca mikroskop sahnesine monte ve amaç ile yağ batırılmış temas yapmak.
Çanaktaki metil salisilat miktarını ayarlayın, böylece menisküs yüzey gerilimi nedeniyle numuneyi uzay makinesinde sıkıca tutun. Mat yüzeyışık saçılımı azaltmak için ters kare substrat üzerine metil salisilat bir damlacık yerleştirin. Sonra buharlaşmayı sınırlamak için bir cam plaka ile çanak kapağı.
Görüntülemeden önce numunenin boşluklara yerleşmesi için birkaç dakika bekleyin. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı gibi örnek görüntü için konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Görüntüleri işlemek için ImageJ veya Fiji'yi açın.
Programın, verilerin işlenmesi için yeterli atanmış belleğe sahip olduğundan emin olun. İki gigabaytlık bir veri kümesinin işlenmesi, sorunsuz bir işlem için en az sekiz gigabayt lık özel RAM gerektirir. İşlenecek seri düzlem görüntü dosyasını açın.
Bilgisayar yığının tamamını işlemek için yeterli RAM'e sahip değilse, alt yığınlar işlenebilir ve tek bir yığın halinde yeniden biraraya getirilebilir. Görüntü menüsü, yazı, 32-bit kullanarak kayan nokta aritmetik işlemlerini etkinleştirmek için verileri 32 bit biçimine dönüştürün. Bu, dosya boyutunu ikikatına çıkar.
Odak lama özelliklerinin karşıtlığını artırmak için düzgün arka planı çıkarın. İşlem menüsüne doğru gezinerek tüm yığını işleyin, arka planı çıkarın. Gerekirse yuvarlanan top yarıçapını ayarlayın.
Top yarıçapı, korunacak odak içi özelliklerin en büyük boyutundan önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Tüm negatif pikselleri sıfıra ayarlamak için her görüntüyü mutlak değerine ekleyin. İlk olarak, resim menüsü, yinelenen, yinelenen yığın kullanarak yığını çoğaltmak.
Sonra işlem menüsü, matematik, mutlak değer kullanarak çoğaltılmış verilerin mutlak değerini almak. İşlem menüsüne, görüntü hesap makinesine, eklemeye yön vererek iki deste ekleyin. Görüntü yığınını eksenel olarak yeniden dilimlemek için görüntü menüsünü, yığınları, yeniden dilimlemeyi kullanın.
Ardından çıkış aralığı 1.0'ı seçin, en üstten başlayın ve enterpolasyondan kaçının. Odak ekseni artık yığındaki dikey eksendir. Yeniden dilimlenmiş yığının Y boyutu odak düzlemlerinin sayısına eşittir.
Yığının bir kısmının veya tamamının yan görünüm projeksiyonu yapmak için görüntü menüsüne, yığınlara, Z projesine gidin. Yan görünüm düzlemlerinin bazılarını veya tümlerini içerecek şekilde başlangıç dilimini ve durdurma dilimini ayarlayın. En iyi sonuçlar için maksimum yoğunluğu seçin.
Görüntü menüsünde gezinerek yan görünüm projeksiyonunun eksenel ölçeklemesini düzeltin, ölçeklendirin. Eksenel ölçek faktörü kullanılarak eşit olmayan görüntü düzlemi pikselasyonu ve odak artış için projeksiyon düzeltilmelidir. X ölçeğini bire ayarlayın ve Y ölçeğini eksenel ölçek faktörüne ayarlayın.
İki kübik enterpolasyon seçin. Yeni pencere oluştur'u seçin. Parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.
Ardından görüntülemek için sekiz bitlik biçime dönüştürün. Alternatif olarak, bir renk arama tablosu uygulayın ve RGB veya sekiz bit renk olarak kaydedin. Artan kırılma indisinin seri olarak yanlış değiştirilebilen çözücüler kullanılarak, netlikte maksimum hızla tahmin edilebilir.
Bu minimum kontrast noktası bulmak için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ile rafine edilir. Bir biyofilm seri ksilen ve bu aralıkta referans sıvılar dar bir dizi arasında değiş tokuş edildi. Her değişimden sonra, aynı alan yeniden değiştirildi ve bir coverglass ile izlendi.
Artan indeksle, kontrast tersi ilk olarak hücre duvarı için 1.530'a eşit olduğunda görülür, bunu n 1.535'e eşit olduğunda sitoplazma takip eder. Mutant ve yabani tip C.albicans biyofilmlerinin derin görüntülemesi burada gösterilmiştir. Yabani tip biyofilm, 538 düzlem konfokal görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 502 mikron kalınlığa kadar büyüdü.
Apeksten baza eksenel projeksiyonlar hücre tiplerinde ve biyofilmin farklı katmanlarındaki değişimi gösterir. Bu örnek, karakteristik vahşi tip yapısını gösterir. Mutant biyofilm 556 düzlem görüntü yığınının yan görünüm projeksiyonunda görüldüğü gibi 500 mikron kalınlığa büyüdü.
Bu mutant indükleyen stres yokluğunda ipliksi büyüme geçmesi bilinen önemli ölçüde farklı bir mimari üretti. Hem yan görünümde hem de eksenel projeksiyonlarda görüldüğü gibi, birçok dallanma hücresi radyal çıkıntılara yol açar. Bu yüksek kırılma indisi derin görüntüleme protokolüdür.
İdeal olarak, numunenin kırılma indisi ve daldırma yağının kırılma indisi eşleşmelidir. Bu nedenle bu durumda, bir petrol daldırma amacı kullanın. Çalışmalarımızın çoğu hücre duvarı belirteçleri kullanılarak biyofilmlerin yapısal görüntüleme, ancak sabit numuneler ile kullanılan herhangi bir floresan yöntemi immünütrioresans, floresan in situ hibridizasyon ve muhabir gen ekspresyonu dahil çalışması gerekir.
Bu özel organizma, Candida albicans, sağlıklı insanlarda kommensal, ama aynı zamanda mukozal veya sistemik mantar enfeksiyonlarına neden olabilir fırsatçı bir patojendir. Bazı kurumlarda BSL II çevreleme yöntemleri ve protokolleri gereklidir. Ayrıca, formaldehit ve glutaraldehit fiksatifler uçucu ve tehlikelidir.
Onlar bilinen karsinojenler. Bir duman başlık fiksatifler seyreltme makyaj. Seyreltilmiş fiksatifler içeren bulaşıkları kapalı tutun ve bu fiksatifleri içeren kapları biyogüvenlik dolabına veya hücre kültürü kuvöze koymayın.
