ביופילמים של קנדידה אלביקנס כמו דגימות ביולוגיות רבות שקופים במידה רבה אטומים במצבם הטבעי. בפרוטוקולים אלה, אנו מראים כי באמצעות שיטות הבהרה, המבנה הפנימי של ביופילמים שלמים קבועים ניתן לדמיין על ידי מיקרוסקופיה חתך אופטי. עם שלבי עיבוד פשוטים, זולים ומהירים יחסית, ביופילמים קבועים שלמים יכולים להתבצע שקופים להדמיה תלת-ממדית על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של סריקה קונפוקלורית.
הפגנת הליך זה היום תהיה קייטי Lagree, חוקר פוסט דוקטורט כאן, ואני. כדי להתחיל צמיחת ביופילם בצלחת 12 באר, להכין את הצלחת כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים את הצלחת על מערבל מסלולית 60 סל"ד באינקובטור אוויר לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות כדי לאפשר זמן להייתוך התא.
לאחר 90 דקות, להסיר את התאים הבינוניים ולא מחוברים לשטוף עם בינוני סטרילי או PBS. מעבירים את המצע מחוסן לתוך צלחת מרובת בארות אחרת המכילה מדיום תסיסה מחומם מראש. החזירו את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס לחות חממת אוויר הסביבה ולגדל את הביופילמים עד 48 שעות עם ערבוב מסלולי של 60 סל"ד לאווירציה.
מוציאים את צלחת 48 השעות מהאינקובטור ומסירים את מדיום התרבות מכל דגימה. החלף את המדיום עם PBS ודגירה במשך כמה דקות כדי לדלל את חלבוני הסרום. לאחר הסרת PBS, מילוי בארות עם תיקון.
נפח קיבוע מספיק יש להוסיף לכל מנה לטבול את כל הצמיחה biofilm כולל כל בצדדים הפנימיים של המנה. מניחים את המנה המוקרה על מערבל מסלולי איטי במשך 20 דקות. לאחר הסרת התיקון כמתואר בפרוטוקול הטקסט, היכונו לכתמים על ידי ניקוז ה- PBS ומילוי מהיר של הבארים בתתא המכיל PBS וכתם הנדרש.
אין לאפשר לביופילם להתנקז או להתייבש במשך יותר מכמה שניות. מוסיפים את הכתם לצלחת. כמות הכתם הדרושה תלויה במסת הביופילם.
לאחר מכן להגדיר את המנה מכוסה על מערבל מסלולית איטית לילה ולהגן מפני אור עם נייר כסף או פיסת נייר שחור. באמצעות פינצטה, להעביר את biofilm ויטריום קבוע מ PBS לחמישה מיליליטר של 50/50 PBS-מתנול בבקבוקון זכוכית 20 מיליליטר עם biofilm פונה כלפי מעלה. מערבבים ידנית עם תנועה מסלולית במרווחים של דקה אחת במשך חמש דקות.
הסר את הממס לבקבוק פסולת להיות זהיר כדי למנוע מגע בין פיפטה ביופילם או biofilm ובקבוקון. מילוי עדין עם שלושה מיליליטר של מתנול מסודר. מערבבים ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של דקה אחת למשך שלוש דקות.
עכשיו להסיר את הממס לבקבוק פסולת ומיד מילוי עם חמישה מיליליטר של מתנול. לאחר ערבוב ידני עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של דקה אחת במשך חמש עד עשר דקות, הסר את הממס לבקבוק הפסולת. מיד מילוי עם שלושה מיליליטר של מתנול.
ביופילמים נראים לעתים קרובות אטומים יותר בשלב זה מאשר המראה הראשוני שלהם. מוציאים את הממס לבקבוק הפסולת ומיד ממילוי הבקבוקון עם חמישה מיליליטר של 50/50 מתנול-מתיל סליצילאט. מערבבים ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של דקה אחת למשך חמש עד עשר דקות.
הביופילם צריך להיות שקוף למחצה בממס המעורב הזה. לאחר הסרת הממס לבקבוק פסולת, מלא בעדינות את הבקבוקון בשלושה מיליליטר של מתיל סליצילאט מסודר. מערבבים ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של דקה אחת למשך שלוש דקות.
חזור על התהליך שוב עם חמישה מיליליטר של מתיל סליסילאט מסודר, ערבוב ידני במרווחים של דקה אחת במשך חמש עד 10 דקות. בשלב זה, הביופילם צריך להיות שקוף. מוציאים את הממס לבקבוק הפסולת ומיד ממילוי הבקבוקון עם שלושה מיליליטר של מתיל סליצילאט מסודר.
הביופילם המעובד יציב בממס הזה. אם אתם משתמשים במיקרוסקופ הפוך, השתמשו בצלחת חסינת ממס עם תחתית כיסוי והכינו חללים לתמיכה בדגימה ההפוכת. כאן, חללים הם 13 מילימטר טבעות סיליקון כי הם ספוגים מראש מתיל salicylate במשך שעה אחת כדי למזער את סחף המיקוד עקב נפיחות.
עבור biofilm על ריבוע סיליקון כיתה רפואית, להפוך את הכיכר ולהגדיר אותו על רווח בבריכה של מתיל סליסילאט בצלחת. הקפד להימנע בועות מתחת לדגימה. הר את המנה בחוזקה על הבמה של המיקרוסקופ ולעשות שמן שקוע במגע עם המטרה.
התאימו את כמות המתיל סליסילאט בצלחת כך שהמניסקוס יחזיק את הדגימה בחוזקה על הרווח על ידי מתח פני השטח. מניחים טיפה של מתיל סליסילאט על גבי תת-התת-קבוצה המרובעת ההפוכים כדי להפחית את פיזור האור מגימור המאט. לאחר מכן מכסים את המנה עם צלחת זכוכית כדי להגביל את האידוי.
המתן מספר דקות עד שהדגימה תתיישב על המרחבים לפני ההדמיה. עכשיו, לבצע מיקרוסקופיה confocal כדי תמונה הדגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לעבד את התמונות, פתח את ImageJ או את פיג'י.
ודא שלתוכנית מוקצה די זיכרון לעיבוד הנתונים. עיבוד ערכת נתונים של שני ג'יגה-בית דורש לפחות שמונה ג'יגה-בתים של זיכרון RAM ייעודי לפעולה חלקה. פתח את קובץ תמונת המישור הסידורי שיש לעבד.
אם במחשב אין די זיכרון RAM לעיבוד המחסנית כולה, ייתכן שמחשבי משנה יעובדו ולאחר מכן יורכבו מחדש לערימה אחת. המר את הנתונים לתבנית של 32 סיביות כדי לאפשר פעולות אריתמטיות של נקודה צפה באמצעות תפריט תמונה, סוג, 32 סיביות. פעולה זו תכפיל את גודל הקובץ.
הפחת את הרקע החלק כדי להגביר את החדות של תכונות ממוקדות. עבד את הערימה כולה על-ידי ניווט לתפריט תהליך, הפחת את הרקע. כוונן את רדיוס הכדור המתגלגל במידת הצורך.
רדיוס הכדור צריך להיות גדול משמעותית מהממד הגדול ביותר של התכונות בפוקוס שיש לשמר. כדי להגדיר את כל הפיקסלים השליליים לאפס, הוסף כל תמונה לערך המוחלט שלה. ראשית, שכפלו את המחסנית באמצעות תפריט תמונה, כפולה, כפולה.
לאחר מכן קח את הערך המוחלט של הנתונים המשוכפלים באמצעות תפריט תהליך, מתמטיקה, ערך מוחלט. הוסף את שתי הערימות על-ידי ניווט לתפריט תהליך, מחשבון תמונה, הוסף. כדי לשנות באופן אקסינלי את ערימת התמונות, השתמש בתפריט תמונה, בערימות, ב- reslice.
לאחר מכן בחר מרווח פלט 1.0, התחל בחלק העליון והימנע מהאינטרפולציה. ציר המוקד הוא כעת הציר האנכי בערימה. ממד ה- Y של הערימה ההרוסה שווה למספר מישורי המיקוד.
כדי לבצע הקרנה של תצוגה צדדית של חלק מהמחסנית או של אורך כל המחסנית, נווט לתפריט תמונה, לערימות, לפרוייקט Z. הגדר פרוסת התחלה ופרוסת עצירה כך שתכלול חלק ממטוסי התצוגה הצדדיים או את כולם. בחר בעוצמה מרבית לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
תקן את קנה המידה של קנה המידה של תצוגת הצד על-ידי ניווט לתפריט תמונה, שינוי קנה מידה. יש לתקן את ההקרנה עבור פיקסלציה לא שוויונית של מישור תמונה והדרגת מיקוד באמצעות גורם קנה המידה של האקסיאלי. הגדר את קנה המידה X לאחד והגדר את קנה המידה Y למגורם קנה המידה צירי.
בחר אינטרפולציה ביקובית. בחר צור חלון חדש. כוונן בהירות וחדות.
לאחר מכן המר לתבנית של שמונה סיביות לתצוגה. לחלופין, החל טבלת בדיקת צבע ושמור כצבע RGB או שמונה סיביות. באמצעות ממסים שונים באופן סדרתי של הגדלת אינדקס שבירה, ניתן הערכה מהירה של הבהירות המרבית.
זה מעודן על ידי מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה קונבנציונלית כדי למצוא את הנקודה של ניגודיות מינימלית. ביופילם אחד הוחליף באופן סדרתי בין קסילן לבין קבוצה צרה של נוזלי ייחוס בטווח זה. לאחר כל החלפה, אותו שדה הועבר והוצג דרך כיסוי.
עם הגדלת המדד, היפוך ניגודיות נראה לראשונה כאשר n שווה 1.530 עבור קיר התא, ואחריו ציטופלסמה כאשר n שווה 1.535. הדמיה עמוקה של ביופילמים מסוג C.albicans מסוג מוטציה ופראי מוצגת כאן. הביופילם מסוג הבר גדל לעובי של 502 מיקרון כפי שניתן לראות בהקרנת התצוגה הצדדית של ערימת התמונה הקונפוקנטית של 538 מטוסים.
תחזיות אקסיאליות מאייפקס לבסיס מראות את השונות בסוגי התאים ובשכבות שונות של הביופילם. דוגמה זו מציגה מבנה אופייני של סוגי בר. הביופילם המוטנטי גדל לעובי של 500 מיקרון כפי שניתן לראות בהקרנת התצוגה הצדדית של ערימת התמונה של 556 מטוסים.
מוטציה זו ידועה לעבור צמיחה filamentous בהיעדר גורם לחץ יצר ארכיטקטורה שונה באופן דרמטי. כפי שניתן לראות הן בתצוגת הצד והן בהקרנות הצריפות, תאים מסתעפים רבים מעוררים תיעורים רדיאליים. זהו פרוטוקול דימות עמוק של אינדקס שבירה גבוהה.
באופן אידיאלי, מדד הש שבירה של הדגימה ואת האינדקס שבירה של שמן טבילה צריך להתאים. לכן במקרה זה, אנו משתמשים במטרה טבילת שמן. רוב המחקרים שלנו היו הדמיה מבנית של ביופילמים באמצעות סמני קיר התא, אבל כל שיטת פלואורסצנטיות המשמשת עם דגימות קבועות צריכה לעבוד כולל immunofluorescence, פלואורסצנטיות בהכלאה situ, וביטוי גנים כתב.
אורגניזם מסוים זה, קנדידה אלביקנים, הוא מתאים בבני אדם בריאים, אבל הוא גם פתוגן אופורטוניסטי שיכול לגרום לזיהומים ריר או מערכתית שמרים. בחלק מהמוסדות נדרשות שיטות הכלה ופרוטוקולים של BSL II. בנוסף, מתקנים פורמלדהיד וגגרגרלדהיד הם נדיפים ומסוכנים.
הם חומרים מסרטנים ידועים. לפצות על דילול של fixatives במכסה המנוע אדים. שמור על כלים המכילים fixatives מדולל מכוסה ולא לשים מיכלים המכילים fixatives אלה ארון biosafety או באינקובטור תרבות התא.
